高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺

00D& MACHINERY食品机械第23卷第5期2007年10月Vo1 23，No. 5Oct. 2007 安全与检测2007年第5期 高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺 Detemm ination of melam ine in high protein food by highperformance liquid chromatography-photodiode array detector 汪辉 曹小彦 彭新凯 陈利国 黄辉谭舸 WANGHui CAO Xiao yan PENG Xin-kai CHEN Li-guo HUANG Hui TAN Ge长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南长沙 410013) (Changsha Center ofSupervision & Inspection on Food Quality Safety， Changsha， Hunan 410012， China) 摘要：建立用高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺的检测方法。对不同样品采用不同的前处理方法，然后用 Agilent TC-C18 4.6×250mm色谱柱，柱温为40℃，流动相为 0.02 mol/L硫酸铵：甲醇=94：6(V ：V)，流速0.8mL /m in，二极管阵列检测器于235 nm 波长下进行检测，并以保留时间和三维光谱图相似性系数进行定性，外标法定量。不同样品的加标回收率为98.8%~101.5%，RSD小于1.2%。方法线性范围为0.1~150p g/mL，检测限为0. 01p g/mL，相关系数 R = 0. 999 9. 关键词：高效液相色谱；二极管阵列检测器；三聚氰胺；高蛋白食品 Abstract： A high perfommance liquid chromatography- photodiode arraydetector for detemmining the content of melam ine in high piotein food wasstudied n this paper， different pre-treatments were used in differentsamples AA Agilent TC-C18 column was used with methanol and0.02 mol/L ammonium sulfate (94：6， V：V) asmobile phase The flowrate was 0. 8 mL /min A diode array detector was used and the detectionwavelength was 235 nm. Qualitative analysis was perfomed with retentiontime and DAD spectrum similarity index value and quantitative analysiswas perfommed with extemal standard methodThe calibration curve waslinear over a range from 0. 1u g/mL to 150. 0p g/mL. The lowest detectedlimit was 0. 01mg/kg The recoveries of different samples were from98.8% to 101.5% and relative standard deviations were less than 1. 0%(n=10). The linearity was0. 1 to150p g/mL， detection lim it of mela-m ine was 0. 01p g/mL and related coefficient was 0. 999 9.Keywords：High perfommance liquid chromatogra phy； Photodiode array detector， Melam ine； High piotein food ( 作者简介：汪辉(1983-)，男，长沙市食品质量安全监督检测中心助 理工程师。 Email： wanghuei158@163. com ) ( 通讯作者：曹小彦 ) ( 收稿日期：2007-06-18 ) 最近美国发生了许多猫狗宠物非正常死亡事件。美国FDA经过调查确认是宠物食品的原料受非法添加的三聚氰胺污染。含三聚氰胺的食物被动物食用后，可以使动物发生肾衰竭并导致死亡。三聚氰胺 (Melam ine)即蜜胺，又称氰尿酰胺，是一种白色晶体，熔点354℃，难溶于水、乙二醇、甘油和吡啶，略溶于乙醇，不溶于乙醚、苯和四氯化碳。按常规三聚氰胺不可能通过环境污染的方式进入食品原料中。通常三聚氰胺只作为生产塑料树脂的原料，其分子中含有大量氮元素(见图1)，不法分子在植物蛋白添加三聚氰胺，是因为其分子中含氮量高达 66.7%。非法添加化工原料三聚氰胺可以提高含氮量，冒充成高蛋白食品，从而大幅度降低成本。用凯氏定氮法"测饲料和食品中的粗蛋白质的含量21，其实只是测氮的含量，再根据蛋白质的含氮量(15%~17%)折算成蛋白质。因此，通常情况下根本不能区分这种伪蛋白氮"。三聚氰胺在高温下可能分解产生氰化物(有较大毒性)，故应避免高温。 图1三聚氰胺的结构式 目前国内外测定食品中三聚氰胺含量的方法很少，一般采用气相-质谱法去相-质谱法、液法色谱法4，5]等。本试验避开毒性大的乙腈，以甲醇和0.02mol/L硫酸铵作为流动相，甲醇提取样品，吹干后 20%的甲醇水溶解并定容，进样，用二极管阵列检测器检测，结果令人满意。 试验材料与方法 1. 仪器与试剂 Waters1525高液相色谱仪：配2996二极管阵列检测器、717Plus自动进样器、Epower工作站； 超纯水处理器：北京东西电子有限公司； 超声清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司； 氮吹仪：天津市恒皇科技发展有限公司； 三聚氰胺(99+%)：SNGMA-ALDR ICH. NC； 硫酸铵(分析纯)：上海试剂四厂； 甲醇(色谱纯)：国药集团化学试剂有限公司。 1.2色谱条件 色谱柱为 Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6mm，5umid)；柱温为40℃；流速为0.8 mL /m in；流动相为硫酸铵(0.02 mol/L)：甲醇=94：6(V：V)；检测波长为235 mm；进样量 10mL6]。 1.3标准溶液的制备 精密称取三聚氰胺对照品25.0 mg于 100 mL容量瓶中，加20%的甲醇水溶解并稀释至刻度，摇匀，使成为250p g/mI的标准储备液。精密吸取三聚氰胺标准储备溶液0.5，1.0，2 0，5.0，10.0 mL，分别置于 25 mL容量瓶中，加20%的甲醇水稀释至刻度，摇匀，使成为浓度为5，10，20，50，100p g/ml标准使用液，经0.45pm的滤膜过滤，按色谱条件进行分析测试(见图2)。以组分峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。 图2标准溶液的色谱图 1.4样品处理 1.4.1固体样品准确角取2.0~5.0g固体样品于50mL的比色管，超声波提取30 m in，放置冷却后，用甲醇稀释至刻度，摇匀。静置30min后取上清液 10 mL氮吹至近干，用20%甲醇水定容至10mL，经 0.45pm的滤膜过滤，待测。 1.4.2液体羊品准确吸取5~10 mL液体样品置于 50 mL比色管中，加入20%甲醇水40mL，加入5%三氯乙酸 5 mL，用20%甲醇水稀释至刻度，摇匀，4000~8000 r/min离心5m in，取上清液，经0.45pm的滤膜过滤，待测(见图3)。 2结果与讨论 21检测波长的选择与定性 取浓度为 50p g/mL的三聚氰胺标准使用液及某待检样 品，在200~400nm波长处扫描，发现三聚氰胺在200~220 mm处有强烈的吸收，在234.1nm处有吸收峰(见图4)，在235.0处的吸收峰峰型对称，存在的干扰少，且流动相在低于210 nm的波长下背景吸收较高，故选用235.0 mm为检测波长。样品中成分复杂，可采用二极管阵列检测器对其进行光谱扫描，并以保留时间和三维光谱图相似性系数进行定性。 图3样品的色谱图 图4标准溶液的 3D图 22流动相的优化 对不同流动相以及不同比例进行了多次试验。结果发现用乙腈为流动相时，乙腈正好在三聚氰胺出峰处有背景吸收，很难分离，且乙乙毒性大。采用硫酸铵(0.02mol/L)：甲醇 =94 ：6(V/V)，三聚氰胺与流动相甲醇的背景吸收完全分开，且峰型对称，出峰时间比较理想。 233沉淀剂的选择 因为三聚氰胺有三个胺基，易与金属离子络合，采用106 g/L亚铁氰化钾 2mL和 219 g/L醋酸锌沉淀蛋白质2mL时，三聚氰胺会有损失，回收率仅为 55%。三聚氰胺是酰胺类物质，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。采用5%三氯乙酸沉淀蛋白质5mL，效果非常理想，但时间不宜过长，避免三聚氰胺包合于沉淀中，降低提取率。 24线性范围与检出限 在试验条件下，用峰面积比对浓度绘制曲线，三聚氰胺在0.1~150p g/mL之间均具有良好的线性关系，以基线噪声三倍峰面积对应的三聚氰胺最低检测限为0.01ug/mL，回归方程式为： ( (下转第124页) ) 3结论 本试验方法利用次氯酸钠将食品中的甜蜜素转化为N，N二氯环己胺，以正己烷萃取后用高效液相色谱法测定110]，待测组分能有效分离，样品测定的精密度、准确度较好，适用范围大，适用性强，便于在日常大批量检测中测定食品中甜蜜素的含量。在本试验方法的基础上，只需调整甲醇和乙酸铵的比例，就可以做苯甲酸、山梨酸、糖精钠试验，适合于检测同时添加了苯甲酸、山梨酸、糖精钠、甜蜜素等添加剂的含乳饮料、果汁饮料等产品。不需要使用气相色谱和液相色谱2种仪器，只需用液相色谱就可以了，避免了资源和能源的浪费。 ( 参考文献 ) ( 1闫福安.国内外合成甜味剂的发展现状及趋势[J].广州食品工业 科技，2003，19(1)：46~47. ) ( 2赵耀.人工合成甜味剂的特点及其发展趋势 [J].食品工业，2004 (8)：30~31. ) ( 3 GB2760- 0——1996.食品添加剂使用卫生标准[S].中国标准出版 社，1996，17. ) 一 (上接第115页) 25精密度试验 取三聚氰胺样品加标溶液做精密度试验，按上述色谱条件及试验方法分别对50p g/mL和 100p g/mL两个不同浓度的样品加标溶液进行测定，重复进样10次，RSD小于 1.2%，说明该方法具有较高的精密度。 26E回收率试验 采用加标测定回收率。取3种样品各3份，分别加入一定量的混合标准使用液。测定结果(见表1，已去本底值)表明：平均回收率基本在 98.8%~101.5%之间，完全可以满足日常分析的要求。 33结论 止方法样品处理简便易行、快速。同时利用二极管阵列检测器定性，成本低于质谱，所测结果准确度高，易于推广，适于测定高蛋白食品中的三聚氰胺。 ( 参考文献 ) ( 1 王箴.化工辞典(第四版)[M]. 北京：化学工业出版社，2003，3. ) ( 25 张亚飞，乐国伟，施用晖，等.小麦蛋白 A lcalase水解物免疫活性肽的研究[J].食品与机械，2006，22(3)：44~46. ) ( 3 GCMS Sc e rm for the P r esence ofMelam ine a nd Cyanuric Acid[ S ].FDA /ORA F o rensic Chem istry Center SOP T015， 2007. ) ( 4 GB/T5009.97——2003.食品中环己基氨基磺酸钠的测定[S]. 中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会，2004. ) ( 5王凯云.食品中甜蜜素的高效液液色谱法[J].福建分析测试， 2004，13(3)：2041~2043. ) ( 6尹艳春，李智红.反相高效液相色谱法同时测定食品中甜蜜素、 糖精钠和苯甲酸钠[J].理化检验-化学分册，2003，39(8)： 469~470. ) ( 77万春花，龙洲雄，朱筱玲.反相液相色谱法测定胡萝卜素[J].食品与机械，2003(2)：37. ) ( 83 刘波.甜蜜素检测方法研究进展 [J].中国食品添加剂，2007(2)： 218~222. ) ( 9 7 刘堋春，祁广建.高效液相色谱法测定冷饮中甜蜜素含量 [J].中 国公共卫生，1997，13(6)：345~345. ) ( 10郑玲，李丽华，郭蔚，等.高效液相色谱法测定食品中的甜蜜素 [J].化学分析计量，2005，14(3)：50~51. ) ( 11 张秀尧.反相高效液相色谱法测定食品中甜蜜素[J].理化检验 -化学分册，2000，36(10)：451~454. ) ( 12 温志海，占春瑞，鄢爱平.液相色谱法测定酱油及其制品中甜蜜素的研究[J].检验检疫科学，2004，14(2)：25~26. ) ( 13 郭伟，张春晖，周明超.液相色谱-电喷雾质谱测定肉类中的 磺黄类药物[J].食品与机械，2004.22(6)：84~87. ) 表1三聚氰胺的回收率 表1三聚氰胺的回收率 添加量 实测值 回收率 平均回收率 样品 /mg /mg /% /% 1.000 0.989 98.9 肉脯 2.000 1.978 98.9 98.8 3.000 2.958 98.6 1.000 1.012 101.2 植物蛋白饮料 2.000 2.032 101.6 101.5 3.000 3.055 101.8 1.000 0.986 98.6 豆粉 2.000 1.976 98.8 98.8 3.000 2.967 98.9 ( 4 Update F CC DevelopmentalMelam ine Quantitation(HPLC-UV)[S].FDA /ORA Forensic Chem istry Center SOP， 2 007. ) ( 5 吴明礼，陈彩虹.高效液相色谱法(HPLC)测定单氰胺中中三聚氰胺的含量 [J].宁夏石油化工，2005(2)：24~26. ) ( 6 施奈德LR，格莱吉克 JL，柯克兰 JJ实用高效液相色普法的建立(第一版)[M].北京：科学出版社，2000，5. ) China Academic Journal Electronic Publishing House. 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