食品中三聚氰胺检测方案

Bottom of Form   高灵敏度-GC/MS 检测食品中的三聚氰胺 修改后的条件可节约成本, 缩短保留时间 Michelle Long(创新化学家) 和 Julie Kowalski博士(食品香料与香味创新化学家)  检测食品,效果较好;吡啶含量低,灵敏度高.  样品处理简单; 衍生化试剂进样体积小,进样口和柱免受污染.  保留时间缩短,灯丝寿命更长. 摘要 气相色谱和质谱(GC/MS)用于分析三聚氰胺和相关的化合物如三聚氰酸, 三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺. 该方法以 FDA方法-GC-MS 方法检测与确认三聚氰胺及其类似物,(第二版, 2007年5月7日)为基础, 经多处修改并优化了分离方法. 分析物通过相对保留时间再配合质谱方法,很容易鉴定. 分析干燥食品中的高或低浓度三聚氰胺是很成功的,基质成分不会同相关的成分共同洗脱出来. 介绍 2007年发生了好多宠物食品招回事件,动物食用污染食品后生病,有些已经死亡.动物生病与三聚氰胺污染有潜在联系, 尽管人们认为三聚氰胺毒性小或几乎没有毒性.三 聚氰胺是一种工业化学原料,用于塑料制品,粘胶, 阻燃剂,纺织和其它原料的生产.三聚氰胺不是食品添加剂,但在宠物食品及其它含蛋白质食品中发现有三聚氰胺. 大家认为它的毒性是由于三聚氰胺与三取氰酸结合形成水不溶性晶体. 晶体在肾脏形成, 收起疾病甚至肾衰竭. 随着研究的深入, 一致认为三聚氰胺和三聚氰胺副产物经常被添加在蔬菜蛋白产品中,如小麦谷蛋白和大米蛋白. 这样可人工提高产品中蛋白质的含量. 凯氏定氮法用于测定蛋白质的含量. 也可测定氮的含量. 蛋白质分解后, 释放出氮,氮转化成氨 . 氨水含量通过滴定的方法测定,同蛋白质的含量也相关. 当样品中加入非蛋白质的含氮成分时,用此方法测定结果偏高,虚假成分太多. 三聚氰胺及其副产品加入蛋白制品中能升高蛋白的含量. 下图展示的是三聚氰胺及副产物的化学结构式,氮含量非常高, 是理想的非蛋白氮原料. 不幸的是, 三聚氰胺副产品不仅含有三聚氰胺, 还有三聚氰酸, 三聚氰酸二酰胺, 和三聚氰酸一酰胺, 导致动物毒性. 鉴于三聚氰胺的副作用, 进口产品需要检测三聚氰胺, 三聚氰酸和相关化合物的含量. 图1:三聚氰胺氮含量高,用做添加剂时能人工提高蛋白质的标示含量 程序 试验方法由美国食品药品管理局, GC-MS色谱法检测与确认三聚氰胺及相关物质, 第二版, 2007年5月7日 样品处理: 三聚氰胺及相关物质购自美国. 所有溶剂全部是方法规定的试剂. 包括所有的原液, 混合标准内标溶剂, 高标准物或低标准物. 高标准物由混合标准溶剂 (100 µg/mL)稀释至 10µg/mL,低标准物稀释至1µg/mL. 洗脱溶剂二乙胺:水:乙腈( 10:40:50 ). 从当地百货市场买回干燥的食品,准备提取试验. 称取粉末0.5g三份: 一份做对照, 一份高标,一份低标. 混合标准液用于标定基质. 高标混合溶剂用250µL ,低标混合溶剂为 50µL. 衍生化: 总共有11个样品要做衍生化处理. 样品包括溶剂, 各个化合物单体, 内标, 高标和低标, 空白, 高低基质. 衍生试验要完全按照给定的方法执行. FDA方法有两处修改. 衍生化试剂从200µL 减至 50µL , BSTFA 含 1% TMCS (cat # 35606). 衍生化试剂的摩尔比要大于50:1.腐化期相应从45分钟增加到120分钟. 仪器参数: 采用岛津 QP-2010 Plus气相色谱质谱仪进行分析 ,仪器装配有AOC 20i+s 自动进样器和样品处理器. 分析柱为Rtx®-5MS 30m x 0.25mm ID x 0.25µm. 进样器为无分流模型 (持续1 min),进样量1µL,进样口温度280°C. 用氦气做载气,流速为1mL/min. 炉箱起始温度为75°C, 迅速以15°C/min的速度升至 320°C (保持 4 min.). 传输管线温度290°C ,离子源温度190°C. 质谱数据用 SIM 模型获得,选择不同的离子源(表 I). 为减少吡啶的含量,灯丝延时 8.1分钟, 每个离子源的保留时间为 0.15 秒. 总共运行18.67 分钟. 表I 质谱条件 (SIM模型) 化合物 保留时间(min.) 目标离子 参考离子 参考离子 参考离子 三聚氰酸 8.97 345 (100)* 330 (36) 346 (30) 347 (15) 三聚氰酸一酰胺 9.79 344 (100) 329 (58) 345 (30) 330 (16) 三聚氰酸二酰胺 10.44 328 (100) 343 (79) 329 (29) 344 (24) 三聚氰胺 10.97 327 (100) 342 (53) 328 (30) 343 (17) 苯代三聚氰酸 13.18 316 (100) 331 (68) 332 (20) 330 (9) * 相对离子比例 数据采集: 所有数据采集均在岛津试验室分离软件上完成(GCMS 分离版 2.5 SU1). 单体标准物可建立数据库用以鉴别样品基质中的化合物. 利用软件的数据比较功能比较标准物和基质的色谱图. Results 图 2 展示的是采用FDA检测的方法高标准混合物的色谱图. 色谱图在刚开始收集数据时,基线较高, 之后慢慢下降. Figure 2: 原方法基线较高, 分散 ,灵敏度低(10µg/mL 标准). 三聚氰酸三聚氰酸一酰胺 三聚氰酸二酰胺 三聚氰胺 苯代三聚氰胺柱子:Rtx®-5MS, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm (cat.# 12623 (​http:​/​​/​www.restek.com​/​restek​/​gotopage.asp?ProductCode=Z75Z5004073​))样品:三聚氰胺, 三聚氰酸, 三聚氰酸一酰胺, 三聚氰酸二酰胺, 苯代三聚氰胺 (10µg/mL 衍生化)进样.:1µL, 无分流(保持1分钟), 3.5mm无分流进样口衬管 (cat.# 22286 (​http:​/​​/​www.restek.com​/​restek​/​gotopage.asp?ProductCode=Z7398Z5004208​))进样温度: 280°C载气:氦气, 恒速流速: 1mL/min.炉箱温度:75°C (保持1分钟) ～320°C (保持4分钟) ,升温速率 15°C/min.检测器: MS传输管线 温度:290°C扫描 范围: 50-450 m/z离子源: EI模型:扫描GC_FF00979 这是由样品溶液中的吡啶造成的. 样品衍生化过程中加入吡啶是必要的,并且能长时间增强离子信号背景. 为解决此问题, 有时吡啶可蒸发掉,其它分析物溶解在GC通用溶剂中. 这样会造成某些分析物损失, 延长样品处理时间. 通过改变质谱扫描仪的质谱范围, 能去除吡啶离子信号, 所有分析物的质荷比都不一样,大于79, 跟吡啶有关. 修改后的方法可扫描 质荷比为85的离子. 两处修改有助于减轻仪器的载荷.衍生化溶剂使用量减少能保持进样口和色谱柱清洁,同时也减少了分析的成本. FDA方法建议溶剂延长时间为 6 分钟. 由于吡啶含量高, 衍生化试剂和基质成分,本方法可增加到 8分钟,多出的2分钟时间能延长灯丝的寿命,确保所有的成分都能检测. . 图 3 是采用新方法高混合标准物的色谱图. 该方法实现了三聚氰胺和三聚氰酸及其它疑似有毒成分如三聚氰酸一酰胺 和三聚氰酸二酰胺的良好的分离. Figure 3: 采用修改的方法实现三聚氰胺及其类似物的良好分离 (10µg/mL 标准). 三聚氰酸三聚氰酸一酰胺 三聚氰酸二酰胺 三聚氰胺苯代三聚氰胺柱子:Rtx®-5MS, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm (cat.# 12623 (​http:​/​​/​www.restek.com​/​restek​/​gotopage.asp?ProductCode=Z75Z5004073​))样品:三聚氰胺, 三聚氰酸 , 三聚氰酸一酰胺, 三聚氰酸二酰胺, 单体标准物 (10µg/mL 衍生)进样.:1µL, 无分流(保持1分钟), 3.5mm无分流进样口衬管(cat.# 22286 (​http:​/​​/​www.restek.com​/​restek​/​gotopage.asp?ProductCode=Z7398Z5004208​))进样温度: 280°C载气:氦气, 恒速流速: 1mL/min.炉箱温度: 75°C～320°C速率15°C/min. (保持4分钟)检测器: MS传输管线 温度: 290°C扫描 范围: EI离子源: SIMGC_FF00978 图 4是带有 the analysis of dry cat food三聚氰胺, 三聚氰酸, 三聚氰酸一酰胺, 三聚氰酸二酰胺 和内标准物苯代三聚氰胺成分的食品分析图. 重现性好, 保留时间稳定,同时还有质谱检测 , 很容易对高水平或低水平三聚氰胺类产品的鉴定. Figure 4: 用SIM方法鉴定三聚氰胺类产品(50µg/g 含量) 样品:干燥宠物食品三聚氰胺, 三聚氰酸, 三聚氰酸一酰胺, 苯代三聚氰胺.参见图3所示条件.GC_FF00977 结论 本方法说明, FDA方法是检测三聚氰胺及相关产品的有意义的指导原则. 使用 Rtx®-5MS 柱和本方法后, 可以达到:1)衍生化试剂用量减小,柱子寿命延长 ,进样口残留减少, 2)增加溶剂延时时间,缩小吡啶离子源背景, 灵敏度比常规分析方法提高约5个百分点. References 1. GC-MS Method for Screening and Confirmation of Melamine and Related Analogs, Version 2, May 7, 2007, U.S Food and Drug Administration , http://www.fda.gov/cvm/GCMSscreen.htm (​http:​/​​/​www.fda.gov​/​cvm​/​GCMSscreen.htm" \t "_new​). 2. FDA Recalls Animal Feed Tainted With Melamine From U.S. Supplier, Steven Reinberg, HealthDay Reporter, http://www.healthfinder.gov/news/printnewsstory.asp?docID=605070 (​http:​/​​/​www.healthfinder.gov​/​news​/​printnewsstory.asp?docID=605070" \t "_new​). 3. Flame-retarding plastics and Elastomers with Melamine, Weil ED and Choudhary V, Journal of Fire Sciences 13 (2): 104-126 Mar-Apr 1995. 4. Final report on the safety assessment of melamine/formaldehyde resin, Anderson FA, Journal of the American College of Toxicology 14 (5): 373-385 Oct 1995.