乳制品中三聚氰胺检测方案

MM/LS/LE-2013-001 ZIC®-HILIC色谱柱快速检测婴幼儿奶粉中双氰胺 默克密理博应用实验室 2013-01-29 1 前言 2013 年1 月，新西兰牛奶及奶制品被检测出含有低含量的有毒物质双氰胺(二氰二氨Dicyanodiamide，DCD），已经下令禁售含有DCD的奶制品。中国的进口奶粉八成来自新西兰，全球60%以上的奶源产自新西兰。新西兰奶农通常会在牧草上喷洒双氰胺，防止肥料中的副产品硝酸盐流入河流和湖泊。 图1 双氰胺分子结构 目前，还没有相应的食品含量标准和检测标准。默克密理博致力于分析方法的开发，为客户提供简便、快速的解决方案。双氰胺极性较强，易溶于水，中性及酸性条件下易电离，适合使用默克密理博的两性离子型亲水作用(ZIC®-HILIC)色谱柱分离。同时，双氰胺在218nm下有强紫外吸收，可以采用ZIC®-HILIC 色谱柱在HPLC-UV条件进行快速分析，亦可在LC-MS/MS进行痕量检测。 2 仪器及试剂 2.1 仪器设备 2.1.1 色谱柱：ZIC®-HILIC, PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm, 5 μm, 200 Å（货号:1.50458.0001） 2.1.2 HPLC：Agilent 1260HPLC(DAD检测器) 2.1.3 单道移液器Transferpette®S，Digital adjustable 500-5000ul（货号：704782 BR） 2.1.4微孔滤膜:0.45um,PTFE(货号：SLFHX13NL) 2.1.5纯水系统:Milli-Q3（Millipore） 2.1.6 PP离心管：50mL,带盖，含底座（货号:114822BR） 2.2 试剂 2.2.1色谱乙腈:LichroSolv®Acetonitrile Gradient Grade（货号:1.00030.4008） 2.2.2乙酸铵：Ammonium acetate for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（货号:1.01116.1000） 2.2.3甲酸：Formic acid 98-100% for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur（货号:1.00264.1000） 2.2.4 2%甲酸溶液：取20ml甲酸，加入1000ml超纯水中 2.2.5乙腈-甲酸溶液：取700ml乙腈（2.2.1）,与300ml 甲酸溶液（2.2.4）混合 3 实验方法 3.1 样品处理 方法1: 取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管（2.1.6）中，加18mL 2%的甲酸水溶液（2.2.4），加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，放入离心机中离心（4000转），20分钟。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加盖密闭，振摇60秒，吸取溶液，过滤，即得供试液。 方法2： 取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4），加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，静置，吸取上层溶液，过滤，即得供试液。 加标样品同法配制。 3.2 测试条件 3.2.1 色谱条件 流动相 (v/v): A-醋酸铵溶液（10 mM）,B-乙腈 比例*：A:B=12：88 流速:1 mL/min 进样量：20ul *必要时设置如下方法对色谱柱进行再生和平衡： 时间，min % % 流速 ml/min 0 12 88 1 等度 10 12 88 1 等度 10.5 30 70 2 再生 15 30 70 2 再生 15.1 12 88 2 平衡 20 2 88 2 平衡 3.3 测试结果 按照方法1处理，结果如下： 3.3.1 对照品测试结果 图1 对照品图谱(DCD浓度1.25ug/ml) 双氰胺保留时间4.98min,理论塔板数13086,拖尾因子1.1. 3.3.2 无检出的奶粉空白 图3 配方奶粉空白 3.3.3 奶粉加标 图4 奶粉加标（测试液中加入的标样浓度:5ug/ml） 图5 奶粉加标（测试液中加入的标样浓度：0.05ug/ml） 3.3.3 某知名品牌奶粉 图6 某进口奶源的知名品牌奶粉图谱 该品牌奶粉中未检出双氰胺. 4 结论 采用ZIC®-HILIC色谱柱，可用于双氰胺的快速检测。处理方法简单，色谱峰型良好，方法重现性良好（RSD<2%）,检测浓度在0.5-10ug/ml之间现行关系良好(R=0.999),加样回收率在95.6-101.5%之间。按照方法1的处理，LOD为1.3ug/g奶粉，按照方法二处理,LOD可达0.07ug/g。 该色谱柱还能用于三聚氰胺、双氰胺、三聚氰酸、二甲双胍、尿素等的同时检测，如： 另外，LC-MS/MS采用如下色谱条件： 色谱柱：ZIC®-HILIC (5 µm, 200Å) PEEK 150x2.1 mm 流动相：A: 95:5 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O B: 50:50 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O 梯度方法 Time (min) Solution A (%) Solution B (%) Flow rate (mL/min) Elution 0.0-5.0 100 0 0.400 isocratic 5.0-12.8 10025 075 0.400 gradient 12.8-15.8 25 75 0.400 isocratic 15.8-16.0 100 0 0.400 equilibration 16.0-24.9 100 0 0.600 equilibration 24.9-25.0 100 0 0.400 equilibration 详细方法可参考： FDA Laboratory Information Bulletin 4487 Journal of Chromatography A 1220 (2012) 101–107 相关详细方法，请联系默克密理博。 Merck Millipore is a division of 有问题请联系默克密理博: Tel +86 21-3850 1881 Email：Jeffrey.lei@Merckgroup.com