血液和尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-180Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-480 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045测定血液和尿液中的乙基葡萄糖醛酸苷 LCMSMS-480 摘要：本文参考《GA/T 1633-2019 法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》，使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了血液和尿液中乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的分析方法。血液和尿液以乙腈沉淀蛋白，离心，取上清液，以0.22 um 滤膜过滤后进样分析。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据，空白血液和尿液中加标制作外标法校准曲线，来定量检测样品中乙基葡萄糖醛酸苷含量。结果表明： EtG 在尿液和血液中的定量限均低于0.1 ug/mL， 满足标准要求；在0.1-10 pg/mL的线性范围内，尿液和血液加标样品各标点浓度准确度分别在92.8-104.3%和92.8-110.0%之间，R均不低于 0.9997；Carryover 考察结果表明尿液和血液高浓度加标样品进样后均无明显系统残留；尿液和血液待测样品检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求。该方法灵敏度和准确度高，适合血液和尿液中的乙基葡萄糖醛酸苷检测。 关键词：LCMS-8045 血液 尿液 乙基葡萄糖醛酸苷 乙基葡萄糖醛酸苷(Ethyl Glucuronide， EtG) 是乙醇在人体内代谢的标志性代谢物。相较于乙醇，其在血液和尿液中存在时间更久，通常情况下，EtG 在血液中的存在时间约为12h， 血液中EtG 检测结果是判定个体在12h 内是否饮酒的重要证据，尤其是在体内已不能检测出乙醇时。此外，血液和尿液中 EtG的测定，对判定乙醇来源、区分是否血液腐败产生乙醇有着重要的意义。 EtG 的检测方法有 LC-MS/MS 和 GC-MS/MS 等， GC-MS/MS检测时，需要对 EtG 进行衍生，前处理较为复杂，而用 LC-MS/MS检测 EtG 则不需要衍生。 本文参考 《GA/T 1633-2019 法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》，使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了血液和尿液中 EtG 的 LC-MS/MS分析方法。该方法前处理简单，灵敏度和准确度高，适合血液和尿液中的 EtG 检测。 实验部分 1.1仪器 岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8045，具体配置为 LC-40BX3(输液泵)， SIL-40C X3 (自动进样器))，CTO-40S(柱温箱)， CBM-40(系统控制器)， LCMS-8045(三重四极杆质谱仪)， LabSolutions Ver. 5.97(色谱工作站) 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱：Shim-pack GIST C18， 150 mm×2.1 mml.D.，3um (SGLC，P/N： 227-30008-07) 流动相： A-0.01%甲酸水溶液；B-乙腈 流速：0.3mL/min 柱温：25℃ 进样量：1uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为7%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.20 Pumps Pump B Conc. 7 1.80 Pumps Pump B Conc. 90 2.80 Pumps Pump B Conc. 90 2.90 Pumps Pump B Conc. 7 6.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8045 加热模块温度：300℃ 离子源： ESI- DL温度：250℃ 雾化气流速： 3.0L/min 离子源温度：400C 加热气流速：10.0 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速：10.0 L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE Q3 Pre Bias (V) 乙基葡萄糖醛酸苷 221.10 75.10* 11.0 16.0 14.0 85.10 11.0 18.0 15.0 *定量离子对 1.3样品前处理 (1)实际样品：参照《GA/T 1633-2019 法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》中“7.1.1.2沉淀蛋白法(适用于液相色谱-一联质谱)”部分，准确移取100uL血液或尿液样品(双平行样)于1.5mL离心管中，加入900 uL乙腈， 涡旋 90s， 13000 r/min 离心3 min， 取上清浓以0.22 um 滤膜过滤后待测。 (2)空白样品和空白基质加标样品：取等量相似基质的空白样品于离心管中，其中一份作为空白样品，其他添加 EtG标准物质作为添加样品(添加样品的浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10 ug/mL， 其中 0.1 ug/mL为标准规定的定量限)，与实际样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。 结果讨论 2.1专属性 空白样品和空白基质加标样品(0.1ug/mL，标准规定的 LOQ) 的 MRM 色谱图如图1所示，空白样品无干扰。 图1尿液(a)和血液(b)空白样品和空白基质加标样品 MRM 色谱图 2.2定量限 参照标准，将空白尿液和血液中分别添加 0.1 ug/mL 的 EtG， 前处理后进样1uL考察方法的定量限，色谱图如图2所示。其中，尿液和血液加标0.1 ug/mL 色谱图中目标峰的 S/N (USP)分别为61.96和59.41，满足标准中关于定量限为 0.1 ug/mL的要求。 图2 空白尿液(a)和血液(b)加标 0.1 ug/mL样品 MRM 色谱图 2.3校准曲线 空白尿液和血液中分别添加0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 ug/mL标样，前处理后进样分析，外标法建立校准曲线如图3所示，线性方程、相关系数及准确度如表3所示。 图33校准曲线(a-尿液加标曲线，b-血液加标曲线) 表3 较准曲线参数 No. 样品 线性范围 线性方程 相关系数 准确度 (ng/mL) r (%) 1 尿液 0.1-10 Y=(35475.35)X+(70.74160) >0.9999 92.8-104.3 2 血液 0.1-10 Y=(33012.47)X- (523.5830) >0.9997 92.8-110.0 2.4 Carryover 考察 空白尿液和血液中添加10.0 ug/mL样品进样后，以空白样品进样得色谱图如图4所示， EtG 保留时间处无明显色谱峰。 图44Carryover考察(a-尿液， b-血液) 2.5重复性考察 对不同浓度的基质加标样品分别连续分析6次，计算保留时间和峰面积的 RSD. 结果见表4，保留时间 RSD均不高于0.30%，峰面积RSD 均不高于 5.86%。 表4保留时间和面积 RSD No. 样品 浓度(ug/mL) 保留时间RSD(%) 峰面积RSD(%) 0.1 0.19 3.54 1 尿液 0.21 1.10 10 0.29 0.53 0.1 0.30 5.86 2 血液 0.13 3.46 10 0.14 0.64 2.6实际样品测定 取尿液和血液样品，各平行制备两份，上机测定，各样品平行样1色谱图如图5所示。 图5尿液(a)和血液(b)样品色谱图 参照标准规定，以保留时间(与空白加标样品保留时间平均值相对偏差不高于2.5%)和离子对相对丰度比(范围由空白加标样品离子丰度比平均值确定，本文中离子丰度比大于50%，要求最大允许相对偏差范围为20%)为定性依据，定性结果如表5所示。尿液和血液待测样品的保留时间以及离子丰度比相对偏差均未超出规定范围，符合要求。 表5 待测样定性结果 No. 样品 保留时间 保留时间相对偏 离子丰度比 离子丰度比相对 (min) 差(%) 偏差(%) 尿液加标样 1.489 99.51 尿液待测样-平行1 1.483 0.40 98.42 1.09 3 尿样待测样-平行2 1.487 0.13 96.76 2.76 4 血液加标样 1.490 98.25 5 血液待测样-平行1 1.484 0.40 103.43 5.27 6 血液待测样-平行2 1.483 0.47 99.48 1.25 参照标准规定，各待测样品均记录2份平行处理样品中目标物的含量，按公式RD=(|C1-C2|/C平均)*100%计算相对相差，结果应不超过20%，结果如表6所示，实际样品的双平行处理样相对相差均不高于20%，符合要求。 表6 待测样定量结果 No. 样品 含量(ug/mL) ——双样相对相差(%) 平行1 平行2 平均值 1 尿液待测样 2.17 2.23 2.20 1.36 2 血液待测样 0.96 0.92 0.94 2.13 结论 本文参考《GA/T 1633-2019 法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》，使用岛津 LCMS-8045 三重四极杆液质联用仪，建立了血液和尿液中乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的分析方法。结果表明： EtG 在尿液和血液中的定量限均低于 0.1 ug/mL， 满足标示要求； 在 0.1-10 ug/mL的线性范围内，尿液和血液加标样品各标点浓度准确度分别在92.8-104.3%和92.8-110.0%之间，R均不低于0.9997；Carryover 考察结果表明尿液和血液高浓度加标样品进样后均无明显系统残留；尿液和血液待测样品检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求。该方法灵敏度和准确度高，适适血液和尿液中的乙基葡萄糖醛酸苷检测。 岛津应用云 乙基葡萄糖醛酸苷（Ethyl Glucuronide, EtG）是乙醇在人体内代谢的标志性代谢物。相较于乙醇，其在血液和尿液中存在时间更久，通常情况下，EtG在血液中的存在时间约为12 h，血液中EtG检测结果是判定个体在12 h内是否饮酒的重要证据，尤其是在体内已不能检测出乙醇时。此外，血液和尿液中EtG的测定，对判定乙醇来源、区分是否血液腐败产生乙醇有着重要的意义。EtG的检测方法有LC-MS/MS和GC-MS/MS等，GC-MS/MS检测时，需要对EtG进行衍生，前处理较为复杂，而用LC-MS/MS检测EtG则不需要衍生。本文参考《GA/T 1633-2019 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》，使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了血液和尿液中EtG的LC-MS/MS分析方法。该方法前处理简单，灵敏度和准确度高，适合血液和尿液中的EtG检测。