扇贝中软骨藻酸检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-179Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-479 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045测定扇贝中的软骨藻酸 LCMSMS-479 摘要：本文参考《GB 5009.198-2016食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定液相色谱-串联质谱法》，使用岛津 LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了扇贝中软骨藻酸的分析方法。扇贝肉搅碎后以50%甲醇溶液提取，强阴离子固相萃取柱净化后，以0.22 um 滤膜过滤后进样分析。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据，空白样品处理后，加标制作外标法校准曲线，来定量检测软骨藻酸含量。结果表明：软骨藻酸在样品中的定量限低于 0.01 ug/g，满足标准要求；空白样品处理后添加软骨藻酸，在2.5-1000 ng/mL的线性范围内，加标曲线各标点浓度准确度分别在90.5-113.2%之间，R为 0.9991； Carryover 考察结果表明ULOQ加标样品进样后无明显系统残留；空白样品添加不同浓度软骨藻酸后进行处理，检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求，回收率在89.4-106.6%之间。该方法灵敏度和准确度高，适合贝类中的软骨藻酸检测。 软骨藻酸 (Domoic acid) 是一种天然神经性氨基酸，为非蛋白氨基酸的一种，主要由某些拟菱形藻属和菱形藻属的海洋硅藻代谢产生。食用含软骨藻酸的贝类后， 可引起食用者记忆丧失、眩晕、昏迷甚至死亡等症状，根据这种毒素的中毒特征，其被命名为记忆丧失性贝毒 (Amnesic Shellfish Poisoning，ASP)。 《GB 5009.198-2016食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定》推荐的检测方法包括：酶联免疫吸附法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。 本文参考该标准第3法，使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了扇贝中软骨藻酸的分析方法。该方法灵敏度和准确度高，适合贝类中软骨藻酸的检测。 实验部分 1.1仪器 岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8045，具体配置为 LC-40B X3(输液泵)，SIL-40CX3(自动进样器)CTO-40S(柱温箱)，CBM-40系统控制器，LCMS-8045三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.97 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack Velox SP-C18， 100 mm×2.1 mm l.D.，2.7um (SGLC，P/N： 227-32003-03) 流动相： A-2mM甲酸铵水溶液；B-甲醇 流速：0.35 mL/min 柱温：30℃ 进样量：5uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.30 Pumps Pump B Conc. 10 1.30 Pumps Pump B Conc. 95 2.50 Pumps Pump B Conc. 95 2.60 Pumps Pump B Conc. 10 6.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8045 加热模块温度：300℃ 离子源： ESI+ DL温度：250℃ 雾化气流速：3.0 L/min 离子源温度：400℃ 加热气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速：10.0L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM参数 序号 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE Q3 Pre Bias (V) 1 软骨藻酸 312.20 266.10* -22.0 -17.0 -30.0 248.10 -22.0 -16.0 -26.0 *定量离子对 1.3样品前处理 (1)试样提取：参照《GB5009.198-2016食品安全国家标准贝类中忆忆性贝类毒素的测定》中“18.3试样提取”部分，称取5g粉碎后的试样于50mL离心管中，加入12 mL甲醇溶液(50%)，涡旋混合1 min，超声提取10 min， 再涡旋混合1 min， 以 4000 r/min 离心 10 min， 移出上清液。残渣再用5 mL甲醇溶液(50%)重复提取两次，合并上清液，以甲醇溶液(50%)定容至25mL， 混匀。于-18℃放置2h后，5℃下10000 r/min 离心15 min，上清液待净化。 (2)试样净化：参照《GB 5009.198-2016 食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定》中“18.4试样净化”部分，准确称取提取液5 mL，于预先活化好的强阴离子固相萃取柱中，分别用5mL乙腈溶液(10%)和0.3mL 甲酸溶液(0.3%)淋洗，弃去流出液，用甲酸溶液(0.3%)4mL洗脱，收集洗脱液，用甲酸溶液(0.3%)稀释至4mL，混匀后以0.22 um的水相滤膜过滤后待测。 结果讨论 2.1专属性 空白样品和空白基质加标样品(LLOQ) 的 MRM 色谱图如图1所示，空白样品无干扰。 Q312.20>266.10(+) 2.67e3 图11空白样品和空白基质加标样品 MRM 色谱图 2.2定量限 参照标准，空白样品中添加 0.01 ug/g的软骨藻酸，前处理后进样样品浓度为 2.5 ng/mL(标准中校准曲线的 LLOQ)，色谱图如图2所示，满足标准中关于定量限的要求。 Area 图2空白加标0.01ug/g样品 MRM色谱图 图33校准曲线 2.3校准曲线 空白样品处理后添加软骨藻酸，酉配置浓度分别为2.5、5、10、50、250、1000 ug/mL的加标样品，外标法建立校准曲线如图3所示，线性方程、相关系数及准确度如表3所示。 表3 较准曲线参数 目标物 线性范围 线性方程 相关系数 准确度 (ng/mL) r (%) 软骨藻酸 2.5-1000 Y=(6782.130)X-(8085.608) 0.9991 90.5-113.2 2.4 Carryover 考察 ULOQ加标样品进样后，以空白样品进样得色谱图如图4所示，软骨藻酸保留时间处无明显色谱峰。 图4Carryover 考察 2.5重复性考察 对不同浓度的基质加标样品分别连续分析6次，计算保留时间和峰面积的 RSD. 结果见表4，保留时间 RSD均不高于0.18%，峰面积 RSD 均不高于 4.63%. 表4 保留时间和面积 RSD 名称 浓度(ng/mL) 保留时间 RSD(%) 峰面积RSD (%) 基质加标样品 2.5 0.14 4.63 50 0.18 1.23 1000 0.07 0.56 2.6回收率及平行样考察 空白样品中添加浓度分别为 20 ng/g(SA1) 和400 ng/g(SA2)的软骨藻酸后进行前处理，各平行制备两份，上机测定。 参照标准规定，以保留时间(与标曲样品保留时间平均值相对偏差不高于2.5%)和离子对相对丰度比(范围由标曲样品离子丰度比平均值确定，本文中离子丰度比为10~20%，要求最大允许相对偏差范围为30%)为定性依据，定性结果如表5所示。保留时间以及离子丰度比相对偏差均未超出规定范围，符合要求。 表5定性结果 No. 样品 保留时间 保留时间相对偏 离子丰度比 离子丰度比相对 (min) 差(%) 偏差(%) 1 标曲样品 1.778 - 19.57 一 2 SA1-平行1 1.793 0.84 21.30 8.84 3 SA1-平行2 1.795 0.96 20.93 6.95 4 SA2-平行1 1.797 1.07 20.09 2.66 5 SA2-平行2 1.798 1.12 20.17 3.07 参照标准规定，各待测样品均记录2份平行处理样品中目标物的含量，按公式RD=(|C1-C2|/C平均)*100%计算相对相差，结果应不超过15%，结果如表6所示，实际样品的双平行处理样相对相差均不高于15%，符合要求。回收率在 89.4-106.6%之间。 表6定量结果及回收率 No. 样品 含量(ng/g) 双样相对相差(%)平均回收率(%) 平行1 平行2 平均值 1 SA1 19.16 23.45 21.31 10.09 106.6 2 SA2 348.36 366.85 357.60 2.58 89.4 结论 本文参考《GB5009.198-2016食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定液相色谱-串联质谱法》，使用岛津 LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了扇贝中软骨藻酸的分析方法。扇贝肉搅碎后以50%甲醇溶液提取，强阴离子固相萃取柱净化后，以0.22 um 滤膜过滤后进样分析。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据，空白样品处理后，加标制作外标法校准曲线，来定量检测软骨藻酸含量。结果表明：软骨藻酸在样品中的定量限低于0.01 ug/g，满足标准要求；空白样品处理后添加软骨藻酸，在2.5-1000 ng/mL的线性范围内，加标曲线各标点浓度准确度分别在 90.5-113.2%之间，R为0.9991； Carryover考察结果表明 ULOQ加标样品进样后无明显系统残留；空白样品添加不同浓度软骨藻酸后进行处理，检测结果满足标准关于定性和定量结果的要求，回收率在89.4-106.6%之间。该方法灵敏度和准确度高，适合贝类中的软骨藻酸检测。 岛津应用云 软骨藻酸(Domoic acid)是一种天然神经性氨基酸，为非蛋白氨基酸的一种，主要由某些拟菱形藻属和菱形藻属的海洋硅藻代谢产生。食用含软骨藻酸的贝类后，可引起食用者记忆丧失、眩晕、昏迷甚至死亡等症状，根据这种毒素的中毒特征，其被命名为记忆丧失性贝毒（Amnesic Shellfish Poisoning，ASP）。《GB 5009.198-2016 食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定》推荐的检测方法包括：酶联免疫吸附法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。本文参考该标准第3法，使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，建立了扇贝中软骨藻酸的分析方法。该方法灵敏度和准确度高，适合贝类中软骨藻酸的检测。