水产品中非法添加检测

1、范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量的液相色谱测定方法。 本标准适用于水产品可食部分中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留量的检测。 2、规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3、术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。

袁彦华 邱庆正 （北京东西分析仪器有限公司，北京 100094） 前言 孔雀石绿（MG）为三苯甲烷类工业染料, 在水产养殖上可以有效的预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小虫病。并常用于鱼苗的消毒。但一些水产品贩运商为保持水产品新鲜度普遍用MG消毒车厢和活鱼池；酒店为了延长鱼的存活时间也在鱼池中投放MG进行消毒。使用MG消毒后的鱼即使死亡后颜色也较为鲜亮，消费者很难从外表进行辨认。MG在水生生物体中的主要代谢产物为无色孔雀石绿（LMG）。MG具有毒性强、高残留和致畸、致癌、致突变等副作用。LMG由于不溶于水，其残留毒性比MG更强。所以，目前世界上诸如美国、日本、加拿大和欧盟等许多国家已将MG列为水产养殖禁用药物，我国也于2002年5月将其列入“食品动物禁用的兽药及其化合物清单”（1）。虽然MG已被列为水产养殖禁用药物，但因为其价格低廉，同时目前在水霉病防治上尚无其它有效药品，因此仍有一些水产养殖户在普遍使用。 各类水产品中MG和LMG的检测是我国食品卫生学面临的新课题。为此，我国农业部2004年颁布了水产品中MG残留量测定的行业标准检验法-液相色谱法（SC/T3021-2004）（2）；国家质量监督检疫总局和国家标准化管理委员会于2005年亦发布了“液相色谱-串联质谱法”和“高效液相色谱法”（（GB/T19857-2005）（3）的标准检验法。Chang-Jun Cha等报道了（2001）采用氰基柱的反相高效液相色谱法和液质联机检测MG（4）。 在上述分析方法中，SC/T3021-2004采用C18柱，等梯度洗脱方式，但需要较大流速（2ml/min）；而 GB/T19857-2005法采用C18柱，梯度洗脱方式。文献（4）采用氰基柱分离的梯度洗脱方式。我们在研究这些分析方法的基础上，采用氰基柱分离、流速为1.0mL/min的等梯度洗脱方式，具有保留时间短、分离效果好、分析速度快、节省试剂；最低检测浓度无LMG为0.02μg/mL，MG为0.05μg/mL。精密度高；特别是线性范围达0.1μg/mL～160.0μg/mL，远远大于 SC/T3021-2004线性范围（MG 0.01μg/m L～0.4μg/mL；LMG0.02μg/mL～0.40μg/mL）。而且，等梯度洗脱方式又扩大了液相色谱的应用范围。 ...... 详细报告请点击下载全文（Word文档）

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8030联用快速测定水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的方法。样品经提取后，用超高效液相色谱LC-30A分离，三重四极杆质谱仪LCMS-8030进行内标法定量分析。样品在2分钟内得到快速分离和检测。孔雀石绿和隐色孔雀石绿在0.5～200 μg/L，结晶紫在0.5～500 μg/L，隐色结晶紫在0.1～200 μg/L浓度范围内线性良好，标准曲线的相关系数均在0.999以上；对1 μg/L、50 μg/L和200 μg/L混合标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积相对标准偏差分别在2.925%和0.160%之下，系统精密度良好；方法定量限为0.1 μg/kg，优于国标《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定》中0.5 μg/kg的要求。

迪马科技在参考《SN/T 1479-2004进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法》和 《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》的基础上开发出中性氧化铝和阳离子交换固相萃取柱串联净化后，反相高效液相色谱柱检测。该方法准确可靠，重复性好，回收率高，可作为水产品中孔雀石绿和结晶紫及代谢物的检测方法。

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8030联用快速测定水产品中孔雀石绿的方法。样品经提取后，用超高效液相色谱LC-30A分离，三重四极杆质谱仪LCMS-8030进行内标法定量分析。样品在2分钟内得到快速分离和检测。孔雀石绿和隐色孔雀石绿在0.5～200 μg/L浓度范围内线性良好，标准曲线的相关系数均在0.999以上；对1 μg/L、50 μg/L和200 μg/L混合标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积相对标准偏差分别在2.925%和0.160%之下，系统精密度良好；方法定量限为0.1 μg/kg，优于国标《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿残留的测定》中0.5 μg/kg的要求。

孔雀石绿（Malachite Green），又名碱性绿、孔雀绿，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，商品孔雀石绿以孔雀石绿草酸盐、孔雀石绿盐酸盐或孔雀石绿氯化物的形式存在，是一种带有金属光泽的绿色结晶体，常用为杀真菌剂或者染料。长期以来，渔民在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿，以预防鱼类的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，同时可以延长鳞受损的鱼的生命。科研结果表明，孔雀石绿在鱼体内残留时间很长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。 2002 年 5 月，我国也将孔雀石绿列入《动物食品禁用的兽药及其化合物清单》中。但是，因其廉价，且治病功效是其他药物“不能替代”的，故利益的驱动使得孔雀石绿并没有完全退出渔业市场。 结晶紫，是甲基紫（Methyl Violet）的俗称，又名龙胆紫，是一类三苯基甲烷类工业染料和消毒防腐药，有较好的杀菌作用，具有高效、廉价、易得等优点，作为化学消毒剂被广泛应用于水产养殖疾病防治中。结晶紫具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，各国也已禁止其在水产养殖业中使用。 天瑞仪器一直致力于为客户提供更完善的解决方案，LC-310 高效液相色谱仪可同时用于水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的检测。

一、使用仪器和试剂： 高效液相色谱仪；紫外分光光度计；电子分析天平；超纯水机；组织捣碎机； 漩涡混匀器；超声波清洗器；高速冷冻离心机；固相萃取仪；氮吹仪。 试剂：三聚氰胺标准品；乙腈HPLC级；庚烷磺酸钠；及色谱纯或分析纯。

本方法基于QuEChERS方法原理，采用酸化乙腈提取，QuEChERS净化，通过UPLC-MS/MS检测。 (1) 方法前处理过程简单、方便，并能同时检测孔雀石绿，无色孔雀石绿，结晶紫，无色结晶紫； (2) 适合水产品和饲料样品的检测，节省时间，降低基质效应，回收率达80%以上； (3) 本方案4种化合物的方法定量限均为0.5 μg/kg，同国标方法《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》一致，可供广大分析工作者使用。 以下为详细解决方案，敬请参考！

本文建立并验证了一种同时测定鱼肉中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的方法。采用固相萃取法对分析物进行提取，并采用液相色谱-正离子多反应监测模式的电喷雾离子化串联质谱法对其进行定量。该方法对鱼肉中所有化合物的定量限均为 0.5 ng/g。这些化合物的动态校正范围为 0.5~100 ng/g。回收率介于 96%~109% 之间，RSD 值介于 1.7%~4.5%。

孔雀石绿（Malachite Green），又名碱性绿、孔雀绿，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，商品孔雀石绿以孔雀石绿草酸盐、孔雀石绿盐酸盐或孔雀石绿氯化物的形式存在，是一种带有金属光泽的绿色结晶体，常用为杀真菌剂或者染料。长期以来，渔民在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿，以预防鱼类的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，同时可以延长鳞受损的鱼的生命。科研结果表明，孔雀石绿在鱼体内残留时间很长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。 2002 年 5 月，我国也将孔雀石绿列入《动物食品禁用的兽药及其化合物清单》中。但是，因其廉价，且治病功效是其他药物“不能替代”的，故利益的驱动使得孔雀石绿并没有完全退出渔业市场。 结晶紫，是甲基紫（Methyl Violet）的俗称，又名龙胆紫，是一类三苯基甲烷类工业染料和消毒防腐药，有较好的杀菌作用，具有高效、廉价、易得等优点，作为化学消毒剂被广泛应用于水产养殖疾病防治中。结晶紫具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，各国也已禁止其在水产养殖业中使用。 天瑞仪器一直致力于为客户提供更完善的解决方案，LC-310 高效液相色谱仪可同时用于水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的检测。

LC/MS 方法 色谱柱 Thermo Scientific Hypersil GOLD 2.1×50 mm，5μm 货号 25005-052130 流动相 A: 水（0.1% 甲酸）B: 乙腈（0.1% 甲酸） 梯度程序：40%A-5%A（0-5min） 进样量 20μL 流速 300μL/min

利用安捷伦高效液相色谱6410 /串联质谱（LC/MS/MS）方法快速、准确地测定孔雀石绿（MG）和隐性孔雀石绿（LMG）的残留量。串联质谱在电喷雾（ESI+），多反应监测（MRM）模式下，进行质谱定性和定量分析，无需采用传统的 PbO2 氧化柱，比液相检测方法灵敏、快速。该方法的定量限（LOQ）为 0.01 μg/kg，完全可以达到出口欧盟和日本残留限量的要求。

本方法参考了上述方案的两种国标的前处理过程，采用不加入还原剂对样品进行前处理，加入内标物质后采用中性氧化铝固相萃取净化目标物，洗脱目标产物后，加入纯净水稀释至指定刻度，液相-质谱/质谱联用检测4种目标化合物。

本文根据GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》和水产行业标准SC/T 3021-2004《水产品中孔雀石绿残留量的测定液相色谱法》，利用我公司高效液相色谱LC-5500 测定水产品中孔雀石绿，并对此方法进行了优化。实验证明该方法在1.0 μg/mL 到160.0μg/mL 之间线性良好，，线性相关系数r≥0.999。方法 精密度和准确度好，最低检测浓度LMG 为2 μ g/kg ，MG 为5 μ g/kg。该方法样品处理简单，线性范围宽，适用于常规质量检测。

孔雀石绿是人工合成的有机化合物。其生产是由1摩尔分子的苯甲醛（Benzaldehyde）和2摩尔分子的二甲苯胺在浓盐酸混和下，加热缩合成隐色素碱（Leuco base），在酸性条件下加过氧化铅使其氧化，并在碱性液中沉淀出色素碱。它属于三苯甲烷型的绿色染料。孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、杀细菌、杀寄生虫的药物，长期超量使用可致癌，无公害水产养殖领域国家明令禁止添加。

本方法参考了GB19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的检测和GB20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定高效液相色谱荧光检测法中前处理过程，采用不加入还原剂对样品进行前处理，加入内标物质后采用中性氧化铝固相萃取柱净化目标物，洗脱目标物后浓缩经液相色谱-质谱/质谱联用检测4种目标化合物。

对于孔雀石绿的检测现有两个国标，分别是GB19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的检测和GB20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定高效液相色谱荧光检测法。其中GB19857-2005采用液质方法对四种孔雀石绿含量分别进行测定，加入内标进行内标矫正。GB 20361-2006法中加入硼氢化钾将孔雀石绿和结晶紫的活泼双键还原，分别形成隐形孔雀石绿和隐性的孔雀石绿，最后再以荧光检测二者的总量。孔雀石绿结构中的双键属于活泼的反应位点，常常容易发生氧化或者去甲基化，导致测试孔雀石绿比较困难。

本文将 Captiva EMR 前处理方法与 LC/QQQ 结合使用，建立了一种同时测定孔雀石绿 (MG)、结晶紫 (CV) 及其代谢物隐色孔雀石绿 (LMG) 和隐色结晶紫 (LCV) 的分析方法。该方法具有快速、操作简单等优点。其中采用过滤式小柱可有效去除水产品中的脂质，同时简化样品前处理步骤，且回收率在 81.8% 以上。

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8030联用快速测定水产品中结晶紫和隐色结晶紫的方法。样品经提取后，用超高效液相色谱LC-30A分离，三重四极杆质谱仪LCMS-8030进行内标法定量分析。样品在2分钟内得到快速分离和检测。结晶紫在0.5～500 μg/L，隐色结晶紫在0.1～200 μg/L浓度范围内线性良好，标准曲线的相关系数均在0.999以上；对1 μg/L、50 μg/L和200 μg/L混合标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积相对标准偏差分别在2.925%和0.160%之下，系统精密度良好；方法定量限为0.1 μg/kg，优于国标《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定》中0.5 μg/kg的要求。

本文将 Captiva EMR 前处理方法与 LC/QQQ 结合使用，建立了一种同时测定孔雀石绿 (MG)、结晶紫 (CV) 及其代谢物隐色孔雀石绿 (LMG) 和隐色结晶紫 (LCV) 的分析方法。该方法具有快速、操作简单等优点。其中采用过滤式小柱可有效去除水产品中的脂质，同时简化样品前处理步骤，且回收率在 81.9% 以上。

孔雀石绿（Malachite Green），又名碱性绿、孔雀绿，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，商品孔雀石绿以孔雀石绿草酸盐、孔雀石绿盐酸盐或孔雀石绿氯化物的形式存在，是一种带有金属光泽的绿色结晶体，常用为杀真菌剂或者染料。长期以来，渔民在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿，以预防鱼类的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，同时可以延长鳞受损的鱼的生命。科研结果表明，孔雀石绿在鱼体内残留时间很长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。 2002 年 5 月，我国也将孔雀石绿列入《动物食品禁用的兽药及其化合物清单》中。但是，因其廉价，且治病功效是其他药物“不能替代”的，故利益的驱动使得孔雀石绿并没有完全退出渔业市场。 结晶紫，是甲基紫（Methyl Violet）的俗称，又名龙胆紫，是一类三苯基甲烷类工业染料和消毒防腐药，有较好的杀菌作用，具有高效、廉价、易得等优点，作为化学消毒剂被广泛应用于水产养殖疾病防治中。结晶紫具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，各国也已禁止其在水产养殖业中使用。 天瑞仪器一直致力于为客户提供更完善的解决方案，LC-310 高效液相色谱仪可同时用于水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的检测。

一、使用仪器和试剂： 高效液相色谱仪；紫外分光光度计；电子分析天平；超纯水机；组织捣碎机； 漩涡混匀器；超声波清洗器；高速冷冻离心机；固相萃取仪；氮吹仪。 试剂：三聚氰胺标准品；乙腈HPLC级；庚烷磺酸钠；及色谱纯或分析纯。

本方法基于QuEChERS方法原理，采用酸化乙腈提取，QuEChERS净化，通过UPLC-MS/MS检测。 (1) 方法前处理过程简单、方便，并能同时检测孔雀石绿，无色孔雀石绿，结晶紫，无色结晶紫； (2) 适合水产品和饲料样品的检测，节省时间，降低基质效应，回收率达80%以上； (3) 本方案4种化合物的方法定量限均为0.5 μg/kg，同国标方法《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》一致，可供广大分析工作者使用。 以下为详细解决方案，敬请参考！

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对于孔雀石绿的检测现有两个国标，分别是GB19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的检测和GB20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定高效液相色谱荧光检测法。其中GB19857-2005采用液质方法对四种孔雀石绿含量分别进行测定，加入内标进行内标矫正。GB20361-2006法中加入硼氢化钾将孔雀石绿和结晶紫的活泼双键还原，分别形成隐形孔雀石绿和隐性的孔雀石绿，最后再以荧光检测二者的总量。孔雀石绿结构中的双键属于活泼的反应位点，常常容易发生氧化或者去甲基化，导致测试孔雀石绿比较困难。

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本方法基于QuEChERS方法原理，采用酸化乙腈提取，QuEChERS净化，通过UPLC-MS/MS检测。 (1) 方法前处理过程简单、方便，并能同时检测孔雀石绿，无色孔雀石绿，结晶紫，无色结晶紫； (2) 适合水产品和饲料样品的检测，节省时间，降低基质效应，回收率达80%以上； (3) 本方案4种化合物的方法定量限均为0.5 μg/kg，同国标方法《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》一致，可供广大分析工作者使用。 以下为详细解决方案，敬请参考！