应用台式MALDI-TOF MS分析mRNA和DNA生产用核苷酸原料的分子量及组成

本文应用台式基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-8020对mRNA体外转录原料NTP以及DNA原料dNTP进了分析，所有原料均检测到了显著的加钠峰，可以对结果进行快速确证。本方法操作简单、检测成本低、分析速度快，结果直接、准确、可靠，有望在mRNA体外转录原料和DNA原料质控方面有更加广泛的应用。SSL-CA22-600Excellence in Science Excellence in ScienceMALDI-038 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 应用台式MALDI-TOF MS分析 mRNA 和DNA生产用核苷酸原料的分子量及组成 MALDI-038 摘要：本文应用岛津台式基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 MALDI-8020 对 mRNA 和 DNA 生产所用的NTP和dNTP原料进行质谱分析，可直接检测到核苷酸原料的分子量及组成形式。本方法操作简便、分析速度快，结果直接可靠，为 mRNA 和 DNA生产相关原料的质量控制提供了参考。 关键词： MALDI-TOFmRNA DNA 原料斗 NTPPCdNTP 技术特点： *一次实验可直接检测到核苷酸原料的分子量及组成形式。 心本方法无需复杂的样品前处理，操作简便，分析速度快，可以进行高通量检测。 mRNA 和 DNA 生产过程中需要用到多种核苷酸类原料。例如， mRNA生产时，体外转录的直接原料为NTP(ATP、UTP、CTP、GTP)， DNA 聚合酶生产DNA时的直接原料为 dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)。核苷酸原料的检测与分析是 mRNA 和 DNA 生产物料质控的重要一环。 本文应用台式 MALDI-TOF 质谱仪 MALDI-8020 对NTP、dNTP 原料进行了分析，直接检测到了原料的分子量及分子组成形式。该检测方法无需复杂的样品前处理、操作简单、分析速度快，检测通量高，结果直接可靠三，)可作为核酸原料质控的日常检测手段。 实验部分 1.1仪器 台式基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 MALDI-8020 1.2分析条件 调谐模式：线性正离子模式激光 能量75-80直：激光器：355 nm 固态激光器离子门阀值300 扫描范围： m/z 300-2000 脉冲引出质量(Da) 1500 1.3样品前处理 取样品加水稀释为100uM， 作为样品工作液。吸取 0.5 uL NaTFA 溶液 (1mg/mL)、1 uL DHB 基质溶液(30mg/mL)、0.5 uL 样品工作液依次点靶，自然干燥后将靶板送入质谱分析。 结果与讨论 2.1 mRNA体外转录原料NTP分子量及组成分析 应用 MALDI-8020 对mRNA 体外转录原料 ATP、GTP、CTP、UTP进行检测，结果见图2，核苷酸的分子式、理论分子量、实测分子量见表1。以图2A为例， ATP检测到 m/z 530.12、m/z 552.16、 m/z 574.13、m/z596.11的离子峰，依次对应 ATP 的[M+Na]*、[M+2Na-H]*、[M+3Na-2H]*以及 [M+4Na-3H]*的化合物形式1.2，可能为 ATP 中三磷酸基团上H离子被Na 离子部分或全部取代后的产物。同样地， GTP、CTP、UTP 也依次检测到了结合1-4个Na 离子的化合物离子形式，结果见表1及图2。除核苷酸目标峰外，样品还检测到基质背景峰，如 m/z 551。 图1 ATP(三磷酸腺苷)结构式(核苷酸结构式示例) 表1 NTP分子式及分子量检测结果 名称 分子式 M+Nal mono [M+2Na-HTTmono [M+3Na-2HT mono [M+4Na-3HTT mono 理论值 实测值 理论值 实测值 理论值 实测值 理论值 实测值 ATP C10H16N5O13P3 529.99 530.12 551.97 552.16 573.95 574.13 595.93 596.11 GTP C10H16N5O14P3 545.98 546.15 567.96 568.10 589.94 590.08 611.93 612.05 CTP C9H16N3014P3 505.97 506.12 527.96 527.94 549.94 549.83 571.92 571.88 UTP CgH15N2015P3 506.96 507.02 528.94 528.85 550.92 550.93 572.90 一一 图22RNA药物生产原料NTP一级质谱图 (A： ATP， B： GTP， C： CTP，D：UTP)注： m/z551为基质背景峰 2.2聚合酶链式反应生产 DNA药物原料 dNTP分子量及分析 应用 MALDI-8020对聚合酶链式反应生产 DNA药物原料 dATP、dGTP、dCTP、dTTP进行检测，结果见图3。如图3A所示， dATP 检测到 m/z 514.16、m/z 536.04、 m/z 558.03、 m/z 579.99 的离子峰，依次对应 dATP 的[M+Na]*、[M+2Na-H]*、[M+3Na-2H]*以及[M+4Na-3H]*的化合物形式，可能为 dATP 中三磷酸基团上H离子被 Na 离子部分或全部取代后的产物。同样地， dGTP、dCTP、dTTP 也依次检测到了结合1-4个 Na 离子的化合物离子形式，结果见表2及图3。 表22CdNTP分子式及分子量检测结果 名称 分子式 [M+Nalt mono [M+2Na-H1Tmono [M+3Na-2H]*mono [M+4Na-3H]*mono 理论值 实测值 理论值 实测值 理论值 实测值 理论值 实测值 dATP C10H16N5O12P3 513.99 514.16 535.97 536.04 557.95 558.03 579.94 579.99 dGTP C10H16N5O13P3 529.99 530.08 551.97 552.09 573.95 574.04 595.93 596.04 dCTP CgH16N3013P3 489.98 489.98 511.96 511.98 533.94 533.90 555.93 555.95 dTTP C10H17N2014P3 504.98 505.23 526.96 526.98 548.94 548.91 570.92 570.95 [M+3Na-2H]' 图3 DNA药物生产原料dNTP一级质谱图 (A： dATP， B： dGTP， C： dCTP，D：dTTP) 注： m/z551为基质背景峰 结论 本文应用台式基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 MALDI-8020 对 mRNA体外转录原料 NTP 以及 DNA原料 dNTP 进了分析，所有原料均检测到了显著的加钠峰，可以对结果进行快速确证。本方法操作简单、检测成本低、分析速度快，结果直接、准确、可靠，有望在mRNA体外转录原料和DNA原料质控方面有更加广泛的应用。 ( 参考文 献 ) 1. Eric Largy， Alexander Konig， Anirban Ghosh， Debasmita Ghosh， Sanae Benabou， Frederic Rosu， andValerie Gabelica. Mass Spectrometry of Nucleic Acid Noncovalent Complexes. Chemical Reviews. 2022，122，7720-7839 2. Noah P. Christian， Steven M. Colby， Lori Giver， Chris T. Houston，Randy J. Arnold， Andrew D. Ellingtonand James P. Reilly. High Resolution Matrix-assisted Laser Desorption/lonization Time-of-flight Analysis ofSingle-stranded DNA of 27 to 68 Nucleotides in Length. RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY，1995， VOL.9，1061-1066 岛津应用云