阿胶中特征肽、驴源多肽A1和驴源多肽A2检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-121Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-465 Email： sshzyan@shimadzu.com.cnTel： 86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045 定性定量分析阿胶药材 LCMSMS-465 摘要：本文建立了一种使用岛津高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用定性定量测定阿胶药材的方法。参照《中国药典》2020年版，阿胶<含量测定>项对阿胶的定量要求，使用胰蛋白酶酶解阿胶样品，选择阿胶的特征肽作为定性依据，驴源多肽A1和驴源多肽A2 作为定量依据；建立了 m/z539.80>612.40 和 m/z 539.80>923.80 检测离子对， m/z 469.25>712.30 和 m/z 469.25>783.40检测离子对，m/z 618.35>779.40 和 m/z 618.35> 850.40检测离子对，且对照品溶液及市售药材中阿胶特征肽的信噪比均远远大于3：1。该方法满足《中国药典》2020年版要求，可实现阿胶药材的快速、准确、灵敏的定性定量分析。 关键词：高效液相色谱 三重四极杆质谱 阿胶定量 驴源多肽 阿胶鉴别 胶类药材是具有典型民族特色的传统中药，为动物的皮熬制而成的明胶类物质。阿胶系驴皮经煎煮浓缩成的固体胶，能补血滋阴、润燥止血，用于贫血心悸、燥咳咯血、先兆流产、产后血虚、肌痿无力，是中医临床常用补益药。阿胶经水解后其胶原蛋白变为分子量更小的肽类，从而失去原有胶原蛋白的性质，这给阿胶鉴别带来一定难度。2015版《中国药典》对阿胶的定性采用液质联用的方法检测阿胶特征肽段，其后，发布了新阿胶(猪皮源)、、牛皮源等以次充好样品补充检验方法。 《中国药典》2020年版，阿胶< 含量测定>保留了氨基酸项，增加了特征多肽项，采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS) 对驴源多肽A1(C41H68N12013)和驴源多肽A2 (C51H82N18O18)进行测定，并规定阿胶中驴源多肽A1 和驴源多多A2 总量计应不得少于0.15%。 本文利用岛津三重四极杆液质联用系统 LCMS-8045对阿胶中的定性特征肽段及驴源多肽进行了分析，建立了阿胶定性定量分析方法，可为该类样品的分析提供参考。 1.1仪器 岛津高效液相色谱仪 LC-20AxR与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统。具体配置为LC-20ADxe×2输液泵， DGU-20A， 在线脱气机， SIL-20ACMP 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8045三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.89 色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (100 mm×2.1 mm l.D.， 2.0 um， SGLC P/N： 227-30001-04) 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液 B相-乙腈 流速：0.30mL/min 柱温：40℃ 进样体积：5pL 洗脱方式：采用梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1 表1 梯度洗脱程序 Time(min) Module Action Value 0.00 Pumps Pump B Conc. 5 20.00 Pumps Pump B Conc. 20 40.00 Pumps Pump B Conc. 50 40.10 Pumps Pump B Conc. 5 50.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI+离子源接口电压：4.5 kV雾化气：氮气3.0 L/min加热气：干燥空气 10.0 L/min驻留时间：10ms DL 温度：250℃ 加热模块温度：400℃ 接口温度：300℃ 干燥气：氮气10.0 L/min MRM参数：见表2 表2 MRM 优化参数 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 驴皮特征肽段 539.80 612.40 -38 -22 -22 923.80 -38 -24 -40 驴源多肽A 469.25 712.30 -16 -21 -32 783.40 -18 -20 -28 驴源多肽A， 618.35 779.40 -24 -25 -32 850.40 -22 -28 -26 1.3对照品和样品配制 供试品制备：取本品粉末0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL， 超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取1mL至5mL量瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用前新制)1mL， 加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，37℃恒温酶解12小时，滤过，取续滤液，即得。对照溶液的制备：取驴源多肽A对照品、驴源多肽A对照品适量，精密称定，加1%碳酸氢铵溶液分别制成每1mL含2.5 ug的混合溶液，即得。 标准曲线配制：精密量取对照品溶液1mL、2mL、5mL、10mL、20mL和25mL，分别置50 mL 量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，制成标准曲线溶液。分别精密吸取不同浓度的标准曲线溶液与供试品溶液各5ul，注入高效液相色谱-质谱联用仪，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线。从标准曲线读出供试品溶液中相当于驴源多肽A和驴源多肽A的量，计算即得。 结果与讨论 2.1阿胶对照药材的 MRM 色谱图 LC-MS/MS分析，获得阿胶对照药材的 MRM色谱图，阿胶特征肽保留时间为 6.75 min， 驴源多肽A保留时间为 4.51 min， 驴源多肽A，保留时间为 5.37 min， 图1中两对特征离子对539.8>612.4以及539.8>923.8的信噪比分别为849和945，满足药典中要求的色谱峰信噪比大于3：1的要求。 图1 阿胶对照药材特征多肽的 MRM 色谱图 2.2标准曲线 根据药典要求，配制标准曲线，经LCMS-8045分析后，以峰面积对浓度作图，绘制外标曲线。驴源多肽A和驴源多肽A标准曲线见图2，标准曲线方程及相关系数等参数见表3。驴源多肽A和驴源多肽A在0.05-1.25 ug/mL范围内，线性良好，相关系数均大于 0.995。 图2 驴源多肽A1和驴源多肽Az的标准曲线图 表3 驴源多肽A和驴源多肽A标准曲线 名称 标准曲线 线性范围((ug/mL) 相关系数R 准确度( (%) 驴源多肽A Y=(1.48188e+006)X-6580.04 0.05-1.25 0.9995 94.3-105.5 驴源多肽A， Y=(290064)X-1040.40 0.05-1.25 0.9998 93.9-113.3 2.3实际样品分析 对市售的一种阿胶药材供试品进行分析，结果如图3所示，阿胶特征肽段通道无干扰，且信噪比均大于10：1，满足药典对于阿胶定性的要求，见表4。 驴源多肽A和驴源多肽A，色谱峰形良好，使用前述标准曲线对供试品进行定量分析，归一化含量为 0.21%，满足药典对于阿胶含量的要求，见表5。 图3 市售阿胶样品的 MRM 色谱图 表4 实际样品中阿胶特征肽分析结果 样品编号 离子对信息 保留时间(min) 峰高 峰面积 信噪比 阿胶特征肽 539.80>612.40 6.75 115017 1603872 1073 539.80>923.80 45804 635228 769 表5实际样品中驴源多肽含量结果 样品编号 离子对信息 保留时间(min) 浓度(ug/mL) 含量 驴源多肽A 469.25>712.30 4.42 0.38 469.25>783.40 0.21% 驴源多肽A， 618.35>779.40 5.34 0.45 618.35>850.40 结论 本文建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8045 鉴定阿胶中特征肽段，实现了阿阿定性定量测定。该方法所检测阿胶特征肽段 MRM 色谱图中离子对539.80>612.40，539.80>923.80 的响应明显，完全满足《中国药典》2020年版要求色谱峰信噪比大于3：1的要求。市售阿胶药材样品分析结果表明，驴源多肽A和驴源多肽A，在 0.05-1.25 ug/mL范围内，线性良好，相关系数均大于0.999。本方法满足《中国药典》2020年版要求，可为阿胶药材的快速、准确、灵敏的定性鉴别以及定量测定提供参考。 岛津应用云 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心 Shimadzu (China) Co.，LTD.-Analytical Applications Center 参照《中国药典》2020年版，阿胶<含量测定>项对阿胶的定量要求，使用胰蛋白酶酶解阿胶样品，选择阿胶的特征肽作为定性依据，驴源多肽A1和驴源多肽A2作为定量依据；建立了m/z 539.80>612.40和m/z 539.80>923.80检测离子对，m/z 469.25>712.30和m/z 469.25>783.40检测离子对，m/z 618.35> 779.40和m/z 618.35> 850.40检测离子对，且对照品溶液及市售药材中阿胶特征肽的信噪比均远远大于3:1。该方法满足《中国药典》2020年版要求，可实现阿胶药材的快速、准确、灵敏的定性定量分析。