厄贝沙坦原料中叠氮类遗传毒性杂质AZBC检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-756Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-599 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 厄贝沙坦原料中叠氮类遗传毒性杂质AZBC的分析 LCMSMS-599 摘要：本文建立了使用岛津超高效液相色色三重四四杆质谱联用仪测定厄贝沙坦原料中叠氮类遗传毒性杂质AZBC的方法。AZBC 在 0.25 ng/mL~25 ng/mL 浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上；对照品连续进样6次，保留时间和峰面积的 RSD 分别为 0.04%和2.36%；低、中、高不同浓度的加标回收率在95.97%~100.55%之间。该方法专属性强、灵敏度高，稳定性好，结果准确，可用于厄贝沙沙原料中AZBC的检测。 关键词：三重四四杆质谱厄贝沙坦遗传毒性杂质叠氮基 AZBC 厄贝沙坦是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)，主要用于治疗成人原发性高血压，属于一线降压药，临床应用广泛。 2018年以来，缬沙坦、厄贝沙坦等沙坦类药物由于可能存在的氮亚硝胺类遗传毒性杂质，如NDMA、NDEA 等被多次召回。近期，韩国生物医药评论 KoreaBiomedical Review 发布消息，赛诺菲-安万特韩国公司表示，由于其他国家提出的杂质问题，该公司将召回三种含有厄贝沙坦的高血压治疗药物。此次召回涉及的杂质是叠氮杂质。 2021年4月29日，EDQM 宣布叠氮杂质是一种新的致突变物质，即遗传毒性杂质。叠氮化合物是医药行业中常见的化工原料，通常作为起始物料、反应试剂或中间体存在于药物合成过程中，如在厄贝沙坦 实验部分 的合成中，通常需要使用三丁基叠氮化锡或叠氮化钠以开成药物结构中的四唑环。遗传毒性杂质叠氮化合物需依据 ICHM7开展研究，并确保叠氮杂质水平低于毒理学关注阈值 (TTC) 的控制限度，确保药品质量安全。本文采用岛津 LCMS-8050 建立了厄贝沙坦原料中叠氮杂质4'-(叠氮甲基)[1，1-联苯]-2-氰基(AZBC)的方法，该方法灵敏、准确，供相关研究人员参考。 图1 AZBC 杂质的结构式 1.1仪器 本实验采用岛津 Nexera XR 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为： 系统控制器： CBM-20A 自动进样器： SIL-20AC XR 输液泵：LC-20ADXRx2 质谱仪： LCMS-8050 柱主箱： CTO-20AC 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 在线脱气机： DGU-20As 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： ACE Excel 3 C18 (150mmx4.6 mm l.D.， 3 um) 流动相：A相-0.01mol/L乙酸铵水溶液-乙腈 (90：10)，B相-乙腈 流速：0.5mL/min 柱温：40℃ 进样体积：10uL 自动进样器温度：10℃ 洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为B相20%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 6.00 Pumps Pump B Conc. 90 7.00 Oven CTO RVR 1 11.00 Pumps Pump B Conc. 90 11.01 Pumps Pump B Conc. 20 13.00 Oven CTO RVR 0 16.00 Controller Stop 注： “0”表示流路切换至废液； “1”表示流路切换至质谱 质谱条件 离子源： APCI，正离子模式DL管温度：200℃离子源接口电压：4.5 kV加热模块温度：250℃雾化气：氮气2.0 L/min接口温度：450℃干燥气：氮气9.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)碰撞气：氩气(230kPa)MRM参数：见表2 表2 MRM 参数 化合物名称 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 4'-(叠氮甲基)[1，1- 133690-91-2 207.10 180.10* -10 -21 -20 耳苯]-2-氰基(AZBC) 77.10 -15 -35 -15 *表示定量离子 标准品溶液的配制及样品前处理 标准工作溶液配制：取AZBC对照品适量，精密称定，加80%乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中含 AZBC约为0.25、0.75、1.25、2.5、5.0、12.5、25ng的溶液。 供试品溶液：取厄贝沙坦原料约25 mg， 精密称定，置50 mL量瓶中，加80%乙腈适量，超声溶解并加80%乙腈稀释至刻度，摇匀。 结果与讨论 3.1厄贝沙坦 UV 图及 AZBC对照品溶液谱图 为避免厄贝沙坦污染离子源的风险，实验中建议配制紫外检测器进行色谱图的监控。根据色谱图中厄贝沙坦与 AZBC 保留时间的差异，将供试品中高浓度的厄贝沙坦切入废液。本实验中，厄贝沙坦与 AZBC保留时间分别为5.850 min 和9.242 min，二者之间的分离度良好。 mAU 40000-]254nm，4nm O帕 3000- 厄贝沙坦 2000 1000- 0 0.0 5.0 10.0 min 图2 厄贝沙坦原料UV色谱图 图3 2.5 ng/mL AZBC标准品溶液质量色谱图 3.2线性关系 将上述AZBC 系列标准工作液按1.2中的分析条件进行测定，外法法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图4所示；所得校准曲线线性关系良好，线性方程为Y=(47795.95)X+(1131.704)，相关系数R=0.9995，准确度在95.5~102.9%之间。 图4 AZBC校准曲线 3.3精密度 对2.5 ng/mL 的对照品溶液连续测定6次，考察仪器精密度。结果显示： AZBC色谱峰保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.04%和2.36%，仪器精密度良好。 表3 AZBC 保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 序号 保留时间 峰面积 1 9.242 148003 2 9.241 144769 3 9.246 150574 4 9.235 144549 5 9.238 153048 6 9.240 151126 RSD(%) 0.04 2.36 3.4专属性 图5-7分别为空白溶液、供试品及供试品加标溶液的 MRM 色谱图，可见空白无干扰。供试品中AZBC 未检出。 图5 空白 MRM 色普图 图6供供品 MRM色谱图 图7供试品加标 MRM 色谱图 根艮检出限MDL=3S/N， 定量限 LOQ=10 S/N 计算检出限和定量限，分别为 0.02和0.06ng/mL。 图8 0.25 ng/mL MRM 色谱图 3.6回收率 取厄贝沙坦样品9份按照2步骤进行前处理，分别加入低、中、高三种不同浓度的 AZBC 标准溶液，按照1.2中的分析条件测定加标回收率，每种浓度平行测定3次。AZBC的回收率在95.97%~100.55%之间，具体结果见表4。 表4 AZBC 回收率测试结果(n=9) 加标示度 (ng/mL) 序号 回收率 (%) RSD(%) 1 95.97 1.25 2 98.14 2.33 3 100.55 1 99.18 2.5 2 97.10 1.14 3 97.42 1 99.58 3.75 2 96.99 1.81 3 100.44 结论 本文建立了使用岛津超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪 LCMS-8050 测定厄贝沙坦原料中叠氮基遗传毒性杂质 AZBC 的方法。AZBC 在 0.25 ng/mL~25 ng/mL浓度范围内线性关系良好，且专属性、精密度及不同浓度的加标回收率实验结果良好。该方法专属性强、灵敏度高、稳定性好结果准确，可用于厄贝沙坦原料中的AZBC检测。 岛津应用云 本文建立了使用岛津超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪LCMS-8050测定厄贝沙坦原料中叠氮基遗传毒性杂质AZBC的方法。AZBC在0.25 ng/mL~25 ng/mL浓度范围内线性关系良好，且专属性、精密度及不同浓度的加标回收率实验结果良好。该方法专属性强、灵敏度高、稳定性好结果准确，可用于厄贝沙坦原料中的AZBC检测。