生物惰性液相色谱分析三种构型的质粒样品

本文使用生物惰性液相色谱仪分析质粒样品，发现温度对3种不同构型质粒的分离影响明显。通过调整温度，可以实现3种构型的分离度均大于1.5。质粒样品重复性分析6次，保留时间和峰面积重复性结果均佳。此方法适用于质粒样品的三种构型分析。SSL-CA23-004Excellence in Science Excellence in ScienceLC-366 生物惰性液相色谱分析三种构型的质粒样品 LC-366 摘要：本文使用生物惰性液相色谱仪分析质粒三种构型，通过优化色谱柱温度，使3种状态质粒分离度均大 于 1.5，实现基线分离。质粒样品重复分析6次，保留时间 RSD 小于 0.1%，峰面积 RSD 小于 1.80%，重复性 结果佳。此方法适用于质粒样品的分析。 关键词：生 物惰性液相色谱 质粒 分离度 重复性 技术特点： *通过色谱柱温度优化，使3种状态质粒分离度大于1.5，实现基线分离。 *使用惰性液相色谱仪分析质粒样品，最大程度减少样品在系统中残留，峰 面积和保留时间重复性佳。 质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的遗 传因子(绝大部分为 DNA) 。其可以进行自主 复 制，并能在细胞分裂时恒定的传给子代细胞。所以，质粒作 为简单易操作的基因载体，广泛用于细胞与基因治疗和 核酸药物领域。 旋含量做了明确要求 (FDA：>80%， NMPA：≥ 90%，SMPA：>85%)。所以很有必要将三种质粒分离，并对其 含量进行确定。 标准的质粒 DNA具有3种基本构型：超螺 旋 (Supercoiled，简称SC)、线性(Linear)和开环 (Opencircular，简称 OC)。其中超螺旋被认为是一种 能够最有效地提高转染效率和目的基因表达量的质粒 形态。在基因治疗的研究中更是对药用质粒的超螺 质粒为含磷酸基团的 DNA， 查阅文献得知，含磷 酸基团样品易在常规液相色谱仪中残留，从而影响分析 的重复性。本文采用生物惰性液相色谱仪分析质粒样品，去除了质粒样品在仪器中的残留。同时 通 过方法优化，将三种构型质粒完全分离，此方法比常规的电泳法有更 高的分辨率和重复性。 实验部分 1.1仪器 生物惰性超高效液相色谱仪，具体配置信息如下： 系统 控 制器 ：CBM-40脱 气 机 儿：DGU-405输液 泵 ：LC-40D XSi×2自动进样器：SIL-40C XSi 柱温 箱：CTO-40C检 测 器：SPD-M40 色谱工作站： LabSolutions Ver . 5.114 1.2分析条件 色 谱 柱： SHIMSEN Ankylo SAX-PM (150×4.6mm 1.D.，5um，岛 津(上海)实验器材有限公司， P/N： 380-01215-64) 流 动 相： A 相-20mM Tris-HCI(pH=8.5)， B 相 -1M NaCl i n 20mM Tris-HCI(pH=8.5) 进样体积 10uL Time(min) Module Command Value 10.00 Pumps Pump B Conc. 90 10.01 Pumps Pump B Conc. 60 15 Control Stop ■结果与讨论 2.1分离度优化 质粒有三种状态，分别为超螺旋 、开环和线性，在分析过程中需要优化液相方法将其分 离 。在确定了流动相 和色谱柱条件后，通过调整色谱柱温度对分离度进行优化。色谱柱温度为 40、30和25℃时采集得到的色谱图 如图1所示，分离度结果如表2所示。结果表明，随着色谱柱温度 的 降低，分离度提高。温度为25℃时，分离 度均大于1.5，实现基线分离 。确认最终色谱柱 温 度为25℃。 图1不 同 色谱柱温度下的色谱图 表2不 同 色 谱 柱 温 度下三种质粒的分离度 色谱柱温度 分离度 开环质粒 超螺旋质粒 线性质粒 40℃ 2.098 0.194 30℃ 2.381 1.362 25℃ / 2.563 1.554 2.2重 复性实验结果 本实验采用惰性液相色谱，将3种状态质粒重复分析6次，考察方法重复性。结果显示，保留时间 RSD小 于0.09%，峰面积 RSD 小于 1.72%，重复性结果良好。 uV(x100，000) 图2 三种状态质粒重复分析色谱图比较 (n=6) 表3 三种状态质粒 重 复性实验结果果((n=6) 质粒状态 保留时间 RSD(%) 峰面积 RSD(%) 开环质粒 0.08 1.72 超螺旋质粒 0.09 1.10 线性质粒 0.09 0.69 结论 本文使用生物惰性液相色谱仪分析质粒样品，发现 温 度对3种不同构型质粒的分离影响明 显 。通 过调整温度，可以实现3种构型的分离度均大于1.5。质粒样品重复性分析6次，保留时间和峰面积重 复 性结果均佳。此方法 适用于质粒样品的三种构型分析。 岛津应用云