饲料中玉米赤霉烯酮检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RK-2021 Knowledge Optimized Laboratory 解决方案 全自动固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中的玉米赤霉烯酮 全自动固相萃取；全自动均质器；全自动氮吹浓缩仪；高高效液相色谱法；玉米赤霉烯酮；；，饲料 介绍 玉米赤霉烯酮是由禾谷镰刀菌、、三三线镰刀菌、粉红镰刀菌等多种镰刀菌分泌的霉菌毒素主要污染玉米、小麦、人米等多种谷物，是对种畜影响最大的类霉菌毒素。玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，畜禽食用后可引发慢性中毒或繁殖技能障碍，严重影响畜禽机体健康，容易给养殖户带来巨大损失，世界各国对玉米赤霉烯酮在饲料中的限值标准有着相应规定。 全自动固相萃取-高效液相色谱法测定饲料中的玉米赤霉烯酮 1.介绍 玉米赤霉烯酮是由禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、粉红镰刀菌等多种种刀菌分泌的霉菌毒素，主要污染玉米、小麦、大米等多种谷物，是对种畜影响最大的一类霉菌毒素。玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，畜禽食用后可引发慢性中毒或繁殖技能障碍，严重影响畜禽机体健康，容易给养殖户带来巨大损失，世界各国对玉米赤霉烯酮在饲料中的限值标准有着相应规定。 图-1玉米赤霉烯酮结构式 本文参考 GB/T 28716-2012《饲料中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》，试样采用80%乙腈水溶液提取，提取液经离心、稀释后用含有玉米赤霉烯酮特异抗体的免疫亲和柱经Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪净化。以甲醇洗脱小柱，经 RaykolEVA 80 全自动氮吹浓缩仪吹干，流动相复溶，高效液相色谱检测，外标法定量。添加上机浓度为 0.1 ug/mL 的加标实验，得到玉米赤霉烯酮的加标回收率在 88%-98%之间， RSD 值小于5%，表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中玉米赤霉烯酮的检测需求。 关键字：全自动固相萃取；；全自动均质器；全自动氮吹浓缩仪；高效液相色谱法；：；玉米赤霉烯酮；饲料 2.仪器与耗材 全自动固相萃取仪：睿科 Raykol Fotector Plus； 全自动液体处理工作站：睿作Raykol Auto Prep 200 全自动氮吹浓缩仪：睿义Raykol EVA 80 全自动均质器：： 睿科 Raykol AH 50 玉米赤霉烯酮免疫亲和柱 (Romer，1500ng/3mL)； 高效液相色谱： Waters ACQUITY UPLC I-Class 配备大体积流通池； 甲醇(Merck，色谱纯)；乙乙(Merck，色谱纯)；吐温-20 (Sigma，试剂纯)；超纯水；PBS 盐包 3.标准曲线配制 使用睿科 Raykol Auto Prep 200 可实现标准品的全自动化配制，，可将母液(50 ug/mL)通过工作站的直接稀释模式，配制一条浓度分别为 0.02 ug/mL， 0.05 ug/mL， 0.10 ug/mL，0.50 ug/mL 和1.0 ug/mL 的标准工作曲线。 图-2. Auto Prep200 液体工作站配标程序 4.样品前处理 4.1提取 准确称取40 g试样于200 mL离心管中，加入4g氯化钠及100 mL 乙腈-水溶液(8：2)(v/v)，用睿科 AH-50 全自动均质器以18000 r/min 的速度均质2 min， 然后以10000 r/min 的转速离心5 min， 取10 mL上清液于50 mL 离心管中，加入40 mL 0.1%吐温-20的 PBS 缓冲液混匀，放入离心机中以10000 r/min 的转速离心5 min， 取 10 mL 上清液于80 mL 玻璃试管中，待用。 4.2净化与浓缩 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus 固相萃取柱 玉米赤霉烯酮免疫亲和柱 (1500ng/3mL) 淋洗 超纯水 洗脱 甲醇 以2 mL/min 的速度精确上样10 mL 待夜液，10 mL水清洗样品瓶，10 mL 水淋洗免疫亲和柱，，气推30 mL压干免疫亲和柱，推速为80 mL/min。最后用1.5 mL甲醇以0.5 mL/min的速度洗脱样品，收集洗脱液用睿科 Raykol EVA 80全自动氮吹仪于55°C条件下氮吹干， 用初始流动相定容至1mL，涡旋混匀，过滤膜上机检测。详细步骤见图-3。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间mirL， 1 清洗样品通道 H20 2.8 2 填充样品路径 H20 40 3 1.3 3 特殊上样 废水 2 10 5.8 4 清洗样品瓶 H20 废水 80 10 6.2 5 淋洗 H20 废水 3 10 3.9 6 气推 废水 80 30 2.2 7 清洗注射泵 CH30H 80 5 0.5 8 洗脱 CH30H 收集 0.5 1.5 3.3 9 气推 收集 0.5 2 4.4 10 气推 收集 40 10 1.1 11 结束 12 图-3. Fotector Plus 玉米赤霉烯酮免疫亲和净化方法 5.检测条件 表-2玉米赤霉烯酮液相色谱检测条件 色谱柱 Waters BEH-C(2.1×100 mm，1.7 um) 流速 0.200 mL/min 流动相 水：甲醇：乙腈=46：8：46 柱温 35°C 进样体积 10uL 梯度洗脱 等度洗脱 荧光检测器 激发波长303nm，发射波长440nm 6.加标测试 取空白试样40 g， 添加上机浓度为 0. 1 ug/mL 的玉米赤霉烯酮标准品，进行上术前处理，回收率结果如下表-3所示。 表-3添加实验的回收率及相对对准偏差结果(n=6) 化合物 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 2 3 4 5 6 玉米赤霉烯酮 91.2 88.6 95.2 94.2 97.4 93.2 95.0 2.9 7.注意事项 7.1.乙腈提取液用 PBS 缓冲液稀释后容易变浑浊，用滤纸过滤混合液效果不佳，因此建议采用高速离心的方式使混合液变澄清以利于后续的过柱。 7.2.免疫亲和柱使用前需提前从冰箱中取出，于25℃回温20分钟左右，冬天室温较低时建议放到温度较高的地方回温。 7.3..对于颜色较深的提取液，第次淋洗小柱改用10 mL 10%甲醇水溶液，第二次再用 10 mL超纯水淋洗。 8.1.采用睿科 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固义萃取仪能同步进行6个样品净化，连续自动处理60个样品，做样通量高；同时可无人值守，大幅度减少了工作人员的工作量，提高了工作效率。此外还可避免工作人员因操作失误导致的检测偏差，也可将实验人员更迭对检测结果的影响最小化。 8.2.睿科Raykol Auto Prep 200 全自动液体工作站可实现混标、标准曲线的配置，全程无需人为值守，让实验人员远离有毒有害物质，保护身体健康。 8.3.睿科 Raykol AH-50全自动均质器采用密计式设计，能有效防止有机溶剂挥发；兼容各种体积的离心管，适配性强；均质完成后可自动进行刀头清洗，避免交叉污染，减少人力耗费。8.4.睿科Raykol EVA 80 全自动氮吹浓缩仪处理量量高，80个样品可同时进行氮吹，实验平行性好；而且采用氮吹针自动追随液面设计，无需手动调节氮吹针高度且耗气量小，省时省力。 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.， Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2020年10月版 网址：：Vwww.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 邮箱： info@raykol.com网址：：Vwww.raykol.com热线： 本文参考GB/T 28716-2012《饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》 ，试样采用80%乙腈水溶液提取，提取液经离心、稀释后用含有玉米赤霉烯酮特异抗体的免疫亲和柱经Raykol Fotector Plus全自动固相萃取仪净化。以甲醇洗脱小柱，经Raykol EVA 80全自动氮吹浓缩仪吹干，流动相复溶，高效液相色谱检测，外标法定量。添加上机浓度为0.1 ug/mL的加标实验，得到玉米赤霉烯酮的加标回收率在88%-98%之间，RSD值小于5%，表明该方法准确度高、精密度好，可以满足饲料中玉米赤霉烯酮的检测需求。