病毒学研究及药物研发中生物分子相互作用分析检测方案(大分子作用仪)

病毒受体识别作者： Rohit K. Jangra， Andrew S. Herbert 等，阿尔伯特爱因斯坦医学院 文章： Evolution of the receptor binding properties of the influenza A(H3N2) hemagglutinin.作者： Yi Pu， Lin ； Xiaoli， Xiong 等，英国国家医学研究所 生物层干涉技术应用文集 Simplifying Progress 病毒学基础研究及药物研发 SARTORILS 目前，新冠肺炎在全球范围内持续肆虐。为应对疫情防控，国家自然科学基金委员会相继发布了新型冠状病毒基础研究及防治应对等方面的项目申请工作。同时，国家自然基金委生命科学部强调在今后的项目资助过程中将积极鼓励科研人员围绕病毒学、病原微生物学、免疫学以及动物模型等开展深入系统地研究，努力推动病毒学及病毒与/免疫系统互作研究的前沿理论与技术。 这些研究涵盖以下方向： ▪病毒起源、进化、宿主和多样性的系统生物学研究 ▪病毒的结构、功能、稳定性与毒力研究 ·病毒跨种传播的机制以及人类、动物与环境互作对病毒跨种传播的作用和影响 ▪人畜共患病的病原、宿主以及传播与演化 ▪冠状病毒与宿主相互作用的细胞生物学过程和分子机制 冠状病毒感染致病动物模型和病毒感染诱导的组织、器官病变机制 ▪天然免疫系统对病毒感染的反应机制及在病毒疾病进程中的功能 ▪病毒感染触发免疫系统紊乱和炎症因子风暴的机制 ▪病毒感染与免疫记忆及耐受形成机制 ▪病毒感染的免疫逃逸机制 ▪疫苗及疫苗佐剂研究 ▪基于病毒学和病毒诱导免疫反应机制的先导化合物研究 目录 生物层干涉技术 (Bio-Layer Interferometry) 原理介绍…… 1 .病毒致病机理…… 3 病毒蛋白结构与功能 4 病毒受体识别1......... 5 病毒感染机制 6 病毒跨种传播 7 病毒免疫逃逸 8 病毒包装机制 9 病毒核酸复制 10 抗病毒药物的发现... 11 埃博拉病毒——受体发现/中和抗体/抗原表位......... 12 SARS-Cov-2病毒—第一个中和抗体发现 14 病毒靶点的先导化合物筛选· 15 HIV病毒——天然产物抗病毒活性 .16 病毒诊断检测..... 17 病毒血清分析 18 诊断抗体研发......... 19 病毒疫苗研究…… 20 流感疫苗效价测定..... 21 血清中疫苗抗体滴度检测 23 总结..... …24 病毒相关部分文献列表·... 25 Octet@仪器型号 30 生物层干涉(BLI) 是一种非标记技术，它将发生在生物传感器表面的光干涉信号转化为实时的响应信号。通过对分子结合过程的实时监测，系统会测定结合常数 (ka 或 kon) 和解离常数(kd或 koff) ，以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力 (KD) 和浓度信息。 Octet@生物传感器由玻璃光纤制成，并在玻璃光纤的末端外/加了特殊的光学层。该光学层为配体的固定提供了表面化学基质 (Figure 1) 。白光(包括可见光谱中的所有波长)被引入玻璃光纤中，并在顶端的两个界面处产生部分内部反射：(1)玻璃光纤和光学层之间(恒定)的界面；(2)表面化学和溶液(可变)接触的界面 (Figure 2A) 。这两个界面产生的两路反射/光会引发光干涉现象 (Figure 2B) ，仪器会对每个波长的干涉光强度予以测量记录，并生成干涉光谱曲线 (Figure 2C)。经历相长干涉的波长在光谱曲线上显示为高振幅，而经历相消干涉的波长则显示为低振幅。Octet@就是通过实时测量干涉光谱曲线的变化，以实现检测分子间相互作用的目的。 FIGURE 1.Anatomy of a BLI biosensor. 当分子与固定在生物传感器表面上的配体结合时，引起光学/层的厚度和密度变化，第二路反射光的路径长度比之前更长(Figure 2D) 。这导致干涉光谱曲线发生改变，并向右产生位/移。当分子和配体解离时，分子会从生物传感器表面解离到溶液中，这将导致干涉光谱曲线向左移动。以干涉光谱曲线的偏移距离(以nm为单位)与反应发生时间绘制的关系图被称为传感图 (Sensorgram) 。通过传感图，可在各种结合模型的基础上拟合出 ka， kd 和 KD(Figure 3) 的数值。 D 分子结合，导致生物层变厚 Q......可变界面 FIGURE 2：BLI原理 FIGURE 3： Conversion of the BLl interferometric profile signal to sensorgrams. BLI 动力学实验流程 Figure 4 展示了在 Octet@仪器上测定结合动力学的标准流程。Octet@的生物传感器提供多种化学界面，无需修饰即可快速轻松地固定配体。动力学传感器均可再生和重复使用，以进一步降低生物传感器的消耗和使用成本。在多通道、高通量 Octet@系统中，可以同时平行检测多对结合反应，缩短实验运行时间，例如文库筛选，表位分类，实验条件优化，浓度梯度依赖性结合分析等。 FIGURE 4： A typical kinetics binding assay workflow using BLI. BLI技术可用于定量分子的浓度，例如lgG、Fc-融合蛋白、人 Fab、含 HIS标签或 GST-融合重组蛋白。应用Octet@或 BLItz系统，生物传感器可在几分钟内确定纯化后或粗制样品中特定分析物的浓度。由分析物与生物传感器结合产生的结合曲线，其结合速率与分析物浓度是有相关性的(Figure 5)。目前 Octet@有针对检测 Protein A、HCP残留以及唾液酸含量的商业试剂盒。用户也可以在Octet@系统上轻松开发自己所需的高灵敏度定量分析方法。 A FIGURE 5； Typical BLI quantitation assay dataset. Binding rates of the standards were calculated from the raw binding curves (A) andplotted against the knownstandard curve (B) to derive the protein concentration in the samples. 本文集通过对 Octet@ 在病毒研究中分子结合动力学相关应/用的梳理和分析，希望能够给广大科研工作者在病毒致病机理、病毒药物发现、病毒诊断检测、病毒疫苗研究等不同领域带来启示和帮助，促进我国病毒学、微生物学、免疫学等相关领域的发展。 病毒致病机理 病毒学研究已经进入到了分子病毒学时代，涉及到病毒感染、基因表达与调控、免疫逃逸机制等。这些过程与机制又涉/及到病毒表面蛋白与受体、细胞膜以及病毒核酸与翻译转录相关蛋白的结构功能以及相互作用关系。Octet@不仅可以检测 DNA， RNA， 脂质体(人工膜结构)，蛋白等生物分子相互作用，而且可以检测病毒蛋白、病毒颗粒水平的相互作用。在数据上，可以获得结合常数(ka)、解离常数 (kd) 以及亲和力常数(KD) 对相互作用进行更加定量化的测定，更细致的研究病毒侵染的分子机制。Octet@操作简便快速，在短时间就可以获得可靠数据，是分子病毒学研究的利器。 病毒蛋白结构与功能 文章： Structure， Function， and Antigenicity of the SARS CoV-2 Spike Glycoprotein. 作者： Alexandra C. Walls， Young-Jun Park 等，华盛顿大学 冠状病毒由S 蛋白介导侵入宿主细胞，S蛋白形成从病毒表面突出的同源三聚体。S蛋白包含两个功能性亚基 S1 和 S2，其中 S1负责与宿主细胞受体结合， S2 亚基负责病毒膜和细胞膜融合。本文证明了人 ACE2可调节 SARS-CoV-2 S 蛋白介导的细胞侵入，从而确定新型冠状病毒的功能性受体，还解析了 SARS-CoV-2S 蛋白胞外结构域三聚体的低温电镜结构。使用Octet@检测发现， SARS-CoV-2 S 蛋白的结构域B与人 ACE2 结合的亲和力与 SARS-CoV 分离株的S蛋白的 结构域B相当，但是解离更慢，这表明SARS-CoV-2S蛋白的结构域B与人ACE2具有较高的结合亲和力。SARS-CoV-2 S蛋白与人 ACE2之间的结合亲和力增强与人类中的病毒传播性和疾病严重性增加相关。这提示着它能够在人类中有效传播，这与迄今为止报道的 SARS-CoV-2 具有人际间很强的传染性结果相一致。Octet@提供的解离信息对病毒与受体亲和力的强弱比较徒到了关键作用。 SARS-CoV-2 S SARS-CoV S Kp(nM) 1.2±0.1 5.0±0.1 kon(M-..s-1) 1.4×10°(2.3±1.4×10) 1.4×10°(1.7±0.7×10) koff (ss71) 1.6×10(1.7±0.8×104) 7.1x10-4(8.7±5.1×10-4) Values reported represent the global fit to the data shown in Figures 2A and 2B and the averages obtained from five (SARS-CoV-2) or four (SARS-CoV)replicates carried out with different protein preparations are shown in parentheses. Nature 文章： Protocadherin-1 is essential for cell entry by New World hantaviruses. 汉坦病毒是一种RNA病毒，可以引起肾综合征出血热 (HFRS)和汉坦病毒肺综合征 (HPS) 。研究人员通过“功能丧失”遗传筛选敲除特定细胞基因后，并观察是否能够阻止汉坦病毒入侵，发现原钙黏蛋白-1( PCDH1) 是汉坦病毒在宿主上结合的靶点。为了进一步验证该基因是靶点基因，作者在三种细胞株上用 CRISPR-CAS9 技术突变了 PCDH1基因，表达无功能的受体蛋白，病毒对这些细胞系的感染能力大大降低。本文用 Octet@验证了 PCDH1与病毒的相互作用，并且确定 结合部位是PCDH1的 EC1-2结构域。因此，这个蛋白结构域成为药物开发的一个潜在靶点。针对 PCDH1 的这个结构域的高亲和力单克隆抗体，能够与肺内皮细胞结合，从而保护它们免受汉坦病毒的感染。作者也用 pull-down 等传统方法定性验证了受体与病毒的结合。Octet@则可以更快速地提供更加精精、定量化的KD， ka， kd 等数据供参考，为病毒与受体靶点的结合提供了有力证据。 用 APS 传感器疏水固化病毒，与EC1-2结构域进行结合解离。 左图为动力学曲线，右图为信号浓度曲线，实验2次重复，结果非常一致。 切克闹，切克闹；煎饼果子来一套，病毒颗粒直接闹，Skr。 文章： Aglycerophospholipid-specific pocket in the RVFV class II fusion protein drivestarget membrane insertion. 作者： P. Guardado-Calvo， K. Atkovska 等，法国巴斯开研究所 裂谷热病毒通过与细胞膜融合介导它在宿主细胞中增殖和感染其他的细胞。本文描述了裂谷热病毒利用一种包膜蛋白插入到宿主细胞膜中并促进细胞膜融合的机制。通过包膜蛋白-脂质复合体的结构分析，证实这种包膜蛋白具有一种特异性的识别细胞膜脂质的亲水性头部的“口袋”。其中氨基酸D961， W821 在这个口袋中，将其突变后， Octet@检测发现包膜蛋白突变体丧失了与脂质的结合能力。重要的是，这种"识 别口袋"不仅存在于裂谷热病毒的包膜蛋白中，而且在由节肢动物传播的其他病毒(如登革热病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒)的包膜蛋白中也被发现。 Octet@验证了包膜蛋白与膜结合的构效关系，确定了病毒的感染机制。BLI是直接检测蛋白-脂质体相互作用的最佳方法之一，而且可以在30分钟内快速生成动力学数据。 将野生型和突变型型膜蛋白固化在 SA传感器与脂质体结合。 发现突变体结合能力变弱或者不结合。 病毒跨种传播 PANS 流感病毒主要依靠病毒表面的血凝素(HA)与宿主多糖受体结合然后介导病毒侵入。禽类受体是 a2'3-唾液酸，而人类受体是a2'6-唾液酸，禽流感病毒能够感染人类，就是因为流感病毒表面蛋白发生了突变，其结合的受体从禽类受体向人受体转变导致。 将多糖受体固定在 Octet@的 SA 链霉亲和素传惑器上，发现其密度分布与细胞表面的受体密度非常相似。因此认为Octet@是非常好地研究流感病毒与其受体亲和力的工具，而且可以直接将病毒本身(不是病毒表面蛋白)作为分析物。结 合曲线上升的越快，说明病毒与受体的结果活性越高，感染能力越强。 1968年H3N2流感病毒大流行来源于禽流感病毒。而从2001年开始，H3N2 病毒对人类受体a26-唾液酸的结合能力显著下降了，说明感染能力下降了。此外，病毒血凝抑制实验等也证实了感染能力的下降，这与 Octet@亲和力检测结果一致。因此， Octet@检测病毒与受体的亲和力就可以预测病毒的传播能力，而且可以直接检测病毒的结合。 生物素化多糖受体在 SA传感器上固化成不同密度， 然后和同一浓度(100pM)的不同型的流感病毒进行反应 病毒免疫逃逸 Cell Host &Microbe 文章： Human Cytomegalovirus Protein UL31 Inhibits DNA Sensing of cGAS toMediate Immune Evasion. 作者： Zhe Fu Huang； Hong-Mei Zou 等，中科院武汉病毒所 在抗病毒的天然免疫机制中， cGAS-cGAMP-STING 是一条经典的通路。cGAS(cyclic GMP-AMP synthase) 在识别病毒DNA后，生成其第二信使cGAMP，cGAMP激活内质网表面的一种蛋白 STING， STING 进而自内质网迁移至高尔基体与TBK1结合并磷酸化 IRF3，最终导致核内Ⅰ型干扰素转录子的启动，引发IFN-a与IFN-B的生成。 人巨细胞病毒 (human cytomegalovirus， HCMV) 是疱疹病毒家族中基因组最大的成员，编码200多种蛋白质，可引发内脏疾病和单核细胞增多症。本文确认了人巨细胞病毒 (HCMV) 基因组中一个合成的蛋白 UL31 是cGAS 的抑制剂。UL31与 cGAS 竞争性结合外源病毒 DNA， 并使得 cGAS分离下来，以此抑制 cGAS 的酶促反应和减少 cGAMP 的生成。UL31的过表达能显著抑制宿主细胞对外源 DNA刺激的抗病毒免疫应答响应。同时，抑制或者敲除UL31能提高HCMV引起的Ⅰ型IFN的分泌和下游抗病毒基因的激活。这些结论强调了 cGAS 在宿主细胞对 HCMV应答反应中的重要性。本文用 Octet@检测并确认了外源 DNA 与 cGAS 及UL31的结合。在 DNA/RNA检测方面，与 EMSA 等传统方法相比，Octet@速度快，使用简便，获得的数据更定量化和可靠。 将 DNA固化在链霉亲和素传感器上，证明 cGAS 以及 UL31都可以与 DNA结合 Journal ofVirology 文章： Binding of the methyl donor SAM to MERS-CoV2'-O-methyltransferase nsp16 promotes the recruitment of the allosteric activator nsp10. 作者： Wahiba Aouadia； Alexandre Blanjoiec 等，艾克斯-马赛大学 MERS-CoV 编码的 cap 2'-0-甲基转移酶可以将病毒 mRNA5'端的 cap-0转化为 cap-1结构，这对于病毒基因组的复制、病毒蛋白质的翻译合成、病毒颗粒的装配以及逃避宿主免疫等过程非常重要。 MERS-CoV 的非结构蛋白 nsp16 是一种2'-O-甲基转移酶，非结构蛋白 nsp10 调节甲基化酶活性，两者形成复合物参与 cap1 型帽子结构的形成。S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 是其甲基化供体。这篇文章发现 nsp16 可以招募SAM 和 cap-0型帽子 RNA， SAM 可以促进 nsp10/nsp16复合物的形成。cap1 型帽子结构形成后， SAM 转换成S-腺苷高半胱氨酸 (SAH)， SAH 的释放促进了 nsp10 /nsp16 的解 离。这些结果表明 SAM / SAH 平衡调节了 cap 2'-O-甲基转移酶的活性。 通过测试多分子体系的相互作用关系， Octet@证明了 SAM具有调节活性的作用。它的存在可以增强nsp10与 nsp16 的结合，并且 nsp10/nsp16 的亲和性增强主要体现在 koff 值变小，解离变得更慢，复合物变得更稳定。这说明 SAM 可以促进 nsp10 /nsp16 复合物的形成。Octet@提供的解离常数等信息为复合物稳定性分析提供了直接依据。 Condition Kd interaction Kon (M"s1) Koff(s) nsp10/nsp16 (uM) Without SAM， SAH 1.24±0.015 3.77x10°±4.35 4.68x10~±0.016x10 With 100 pM SAM 0.15±0.001 3.98x10°±2 6.23x10±0.031x104 With 20 pM SAH 0.48±0.003 3.10x10*±1.97 1.51x10±0.004x10 With 100 pM SAH 0.19±0.0013 3.3x10°±2.2 6.51x10±0.041x104 100- 80- 60- 口100 pM SAM ◆100 pM SAH A20 pM SAM ●20 pM SAH 20- 05pM SAM ●5pM SAH OBuffer alone 04 0 200 400 600 800 Temps (s) ( 将nsp10 固化在 SA 传感器上，与加入 SAM 或 者 SAH 的 n s p16结合解离。 ) 左图是动力学参数，右图在 nsp16结合后的解离中加入 SAM 或者SAH， 发现解离变慢。 作者： Ruchao Peng； Xin Xu 等，中科院微生物所 砂粒病毒科病毒可引起人类和其他动物的严重出血热和神经系统疾病。其基因组编码一个RNA复制酶(RdRp，L蛋白)，这种病毒的基因组复制是从头开始的，并涉及一个互补RNA(cRNA)中间产物。本文分别介绍了两种具有代表性的砂粒病毒科病毒 Lassa 乳腺病毒 (LASV) 和 Machupo 乳腺病毒(MACV) 的全长复制酶的结构，并探讨了病毒复制的机制。 为了研究L蛋白与RNA启动子之间的相互作用关系，作者利用 Octet@ 检测 LASV 和 MACV的L蛋白分别与 3'-vRNA(病毒RNA) 和 5'-vRNA 链的结合。发现两种病毒的L蛋白都显示出与 3'-vRNA有很强的结合，而 cRNA启动子序列与 vRNA 的序列几乎相同，Octet@动力学测试表明LASV 和MACV的L蛋白与 3'-vRNA和3'-cRNA的结合都非常牢固，且几乎没有解离，两者的亲和力类似。此外，砂粒病毒的L蛋白有个特殊的垂坠结构域，虽然删除这个结构域的L 蛋白的复制与转录活性降低，但是 Octet@动力学检测表明这并没有降低L 蛋白与 cRNA 和 vRNA启动子的亲和力。这些发现增强了研究人员对砂粒病毒复制机制的理解，为开发抗病毒疗法提供了重要基础。RNA 本身稳定性差， RNA与蛋白的互作检测需要在短时间内完成才能保证结果可靠。 Octet@通量高，速度快，操作简便，保证了结果的可靠性。 抗病毒药物的发现 病毒感染是人类面临的巨大挑战，特别是以 SARS、 SARS-Cov-2、MERS、埃博拉、高致病性禽流感等为代表的突发性重大/传染病严重危害公共卫生安全。通常特异性的疫苗和小分子/化学药物是对抗病毒感染最强大的“武器”，但是，在突发新型病毒出现时往往无现成药物和疫苗可用，如何快速实现抗病毒药物的筛选是广大科研工作者的焦点。抗体是机体对抗病毒感染最重要的武器之一， SARS 期间直接收集痊愈患者的血清治疗重症患者的实践，直接折射出抗体对于治疗此类感染疾病的重要性。病毒感染康复者血浆对治疗新型病毒非常有效，新型病毒康复者人数有限，血清中和滴度也存在参差不齐以及安全性的问题。因此需要通过快速制备中和抗体以应对新型急性病毒的方法。Octet@不仅可以高通量快速筛选药物与靶点的相互作用，还可以获得更加精细化、定量化的动力学数据为药物的筛选与分析提供了科学依据。Octet@对有机溶剂 ( DMSO 等)的高耐受性极大方便了小分子药物的筛选，且假阳性率极低。同时 Octet@ 专有的浸入即读分析模式能够满足在早期阶段粗制中和抗体的高通量筛选需求。 埃博拉病毒——受体发现/中和抗体/抗原表位 Science 文章： Structural and Molecular Basis for Ebola Virus Neutralization byProtective Human Antibodies. 作者： Misasi， J.； Gilman， M. S. A. 等，美国国立卫生研究院 & 清华大学 Science ( 文章： Is o lation of p o tent neutralizing antibodies from a survivor of t h e 2014Ebola virus outbreak. ) 作者： Zachary A. Bornholdt； Hannah L. Turner 等，美国斯克利普斯研究所 Science 文章： Protective monotherapy against lethal Ebola virus infection by apotently neutralizing antibody. 作者： Davide Corti； John Misasi 等，美国国立卫生研究院 J.Infect.Dis. 文章： Development of Clinical-Stage Human Monoclonal Antibodies ThatTreat Advanced Ebola Virus Disease in Nonhuman Primates. 作者： Kristen E. Pascal； Drew Dudgeon 等，三生元公司 2019年5月，具有传奇色彩的中和抗体 mAb114 被美国 FDA授予突破性药物资格，其可将埃博拉病毒的致死率从67%降低到11%。2016年，研究人员在埃博拉毒毒的幸存者体内分离到349株抗体，使用 Octet@的 Octet HTX 进行高通量筛选，筛选获得一株单克隆抗体(mAb114)，能够有效地保护感染了埃博拉病毒的猕猴。通过对 mAb114 进行结构和功能解析发现，埃博拉病毒表面糖蛋白(GP)和人体内的内涵体和溶酶体上的 NPC1受体发生结合，随之介导侵入人体。因此 需要检测酸性条件下抗体与 GP的结合能力，以及其阻断 GP与 NPC1 结合的能力。Octet@结果显示， mAb114 的 Fab片段在中性(pH7.4)和酸性(pH5.3)环境下都可以牢固地结合GP 蛋白，亲和力均为 0.1nM 级别。 Octet@独有的浸入即读式分析模式，使其可在不同分析缓冲液中灵活切换，满足复杂实验和样本的需求。竞争结合实验显示， mAb114 与 GP结合后，可进一步阻断其与NPC1受体的结合。 mAb114 的 Fab段与 GP 蛋白在中性和酸性条件下的结合动力学比较 AR2G传感器固化 GP， 并依次与不同的抗体和 NPC1受体结合。 当 mAb114与之竞争时， NPC1的结合信号大幅降低，说明mAb114抗体可以 有效阻断两者的结合反应，发挥中和功能。 另外一种埃博拉中和抗体“神药”是再生元公司的鸡尾酒疗法REGN-EB3，由三种单克隆抗体组成。使用Octet@进行表位分析 (epitope binning) 通过发现三种抗体识别的抗原的表位并不相同，为抗体鸡尾酒疗法提供理论依据。在中和病毒抗体研究中， Octet@可以提供完整的解决方案，不仅可以 高通量的筛选粗制样品中的中和抗体，获得动力学信息。同时可以对获得的抗体进行表位分析数据，配上专有的表位分析软件，可实现数据的一键分析，帮助研究人员从海量的样品本中高效的甄别出有效的中和抗体。 HIS1K传感器固化 GP 蛋白，并依次结合不同表位的抗体， 前面结合的抗体对后续的抗体结合并无影响，说明不同的抗体结合 GP蛋白的表表不相同。 SARS-Cov-2病毒——第一个中和抗体发现 Emerg.Microbes Infect. 文章： Potent binding of 2019 novel coronavirus spike protein bya SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody.作者： Xiaolong Tian； Cheng Li 等，复旦大学 2020年1月11日第一条SARS-CoV-2基因序列由复旦大学张永振团队公布，紧接着1月28日，复旦大学应天雷团队发表文章，在全球第一次鉴定出新冠病毒S蛋白与ACE2 受体的结合动力学，它与 SARS-CoV 表现出相似的亲和力意味着两种病毒具备这相近的易感性。正因为这种相似性，作者选取了报道过的针对 SARS-CoV S-RBD 蛋白的3株中和抗体(CR3022， CR3014 和m396)用 Octet@进行动力学筛选实验。结果发现，抗体 CR3022与 SARS-CoV-2-S-RBD具备很强的结合力，KD可达6.28nM。另外两株则完全不结合。不过，竞争实验却发现 CR3022并不能阻断病毒与 ACE2受体 的结合。但是，鉴于 CR3022 曾经在 SARS-CoV 治疗中跟抗体CR3014良好的联用效果， CR3022 对 SARS-CoV-2来说依然是可能的潜在的中和抗体。研究人员依然保持着对CR3022抗体进行深入研究的兴趣。在病毒爆发的过程中，及时获得病毒感染、基因表达与调控、免疫逃逸等作用机制，可以有效的指导病毒的预防、控制以及治疗等。应天雷团队从病毒序列公布到拿到结合活性数据仅仅只花了14天，使用简单、快速、高通量的 Octet@可以有效地帮助研究人员在竞争激烈的药物研发中脱颖而出。 CR3022 与 ACE2 的竞争实验 病毒靶点的先导化合物筛选 J. Comput. 文章： Biosensor-based small molecule fragment screening withbiolayer interferometry. Aided Mol. D作es.者： Charles A. Wartchow； Frank Podlaski 等，罗氏公司 真核翻译起始因子 4E(eukaryotic translation initiation factor4E，elF4E) 在翻译调控过程中参与多种细胞过程包括细胞增殖、凋亡和分化等。elF4E 在病毒 mRNAs 的翻译机制过程中起重要作用，不仅影响病毒蛋白合成，还可促进已感染细胞增殖以及病毒活性再激再。针对 elF4E的靶向治疗，将为以病毒感染为主的恶性肿瘤治疗提供新的思路。 罗氏公司的研究人员利用Octet@将重组表达纯化的蛋白elF4E 固化至 SSA 传感器上，对6500种化合物的片段文库进行了筛选，由于 Octet@对溶剂不敏感，避免了小分子实验 中 DMSO 溶剂导致的假阳性，多通道检测实现高通量筛选，且避免少数小分子水溶性不佳的问题导致设备受损。elF4E同时包含蛋白-蛋白相互作用位点和核酸结合位点，研究人员同时与时间分辨荧光分析筛选得到的结果进行了对比。结果显示， Octet@可以精准快速地进行数据的处理与分析，可通过结合图谱以及响应值有效地将初级苗头化合物从非特异性或非理想的相互互用(非典型结合)中区分开来。Octet@可以进一步确认候选化合物的结合，并克服传统生化分析法带来的假阳性和假阴性等缺点。 Compound 通过单浓度的化合物筛选实验，甄别出有明显结合的苗头化合物 0.008coa 0.0 Time [s) 多浓度检测中进一步确认有浓度梯度的结合信号的候选化合物，并鉴定非典型的结合(G-I信号比较高，呈现小分子的非典型解离) 高灵敏度加高通量，化合物筛选就是这么简单哈! HIV病毒——天然产物抗病毒活性 Biochimica etBiophysica Acta 文章： Anti-HIV-1 activity and structure-activity-relationship studyof a fucosylated lycosaminoglycan from an echinoderm bytargeting the conserved CD4 induced epitope. 作者： Lian， Wu； Wu， Mingyi 等，中科院昆明植物所 HIV-1包膜糖蛋白120(gp120)可识别细胞CD4的CD4i区域。CD4i 被视为是抑制 HIV-1进入细胞的潜在目标。从海参中提取的岩藻糖化糖胺聚糖 (Fucosylated Glycosaminoglycan，FG)是一种新型硫酸化多糖，其细胞毒性小，具有较强的抑制HIV-1病毒活性。作者利用 Octet@详细研究了这种机制，分析了FG 抗HIV-1活性的分子动力学，并建立了 FG 的结构和生物活性之间的关系。 结合实验显示 FG 的衍生物 FG3 与 gp120 分子之间存在特异性结合，而与 CD4分子没有结合。通过多浓度的动力学 测定表明 FG3 与 gp120 的结合作用非常强，亲和力达到4.27nM。 在FG3与 gp120结合的基础上，作者建立了竞争性抑制试验来观察其它多糖对 FG3 和 gp120分子相互结合的影响。结果表明，在 CD4 存在下，抑制 gp120 结合的效力排序是 FG>DexS >Heparin。Octet@不仅可以满足常规的动力学与药物药效活性筛选，同时灵活的实验设计可从多个维度对药物的活性进行分析与筛选。 (+CD4) 05 0.4 一Eco FG (nM) 0.3 O O.125 0.2 .0.25 0.5 0.1 0.0 0 500 1500 2000 不同多糖的竞争实验：将不同浓度的肝素 (Heparin)、硫酸葡聚糖(DexS) 以及 FG 混入一定浓度的 gp120/scd4复合物中，然后与固化在 SA 传感器上的 FG3相互作用 病毒诊断检测 病毒，细菌，真菌，支原体及寄生虫等微生物在自然界广泛/存在，其中不乏很多致病性强，传播能力强的传染致病原，甚至可以在人和动物间相互传播。比如我们正在经历的SARS-CoV-2 等。从公共卫生及大众健康角度来说，预防疾病的快速传播显得非常重要，尤其是实现病原菌的快速检测。这其中的关键一点就是要及时找到感染的原因，最好直接从经过最少处理的生物样本中找出致病原。然而，常见的临床诊断样本，如血清、血液、唾液、粪便和尿液等往往是粘稠、浑浊的或含有颗粒的，对于基于管路系统的检测设备就会造成很大的困难。如果基于 ELISA 等的光学检测，则有色样本材/料又会导致问题。因此，基于无标记检测非流路系统的Octet@就可以很好地克服上述困难，同时还可以通过信号放大的设计来保证 pg 级别的检测灵敏度。此外，病毒诊断检测中还涉及到大量的诊断抗体及相关抗原的筛选研发以及表位配对工作。Octet@的高通量，高灵敏，操作灵活，无污染，成本低等特点可以极大地满足相关工作的需求。 Sens. Actuators 文章： Rapid and sensitive detection of norovirus antibodies inhuman serum with a biolayer interferometry biosensor.B Chem. 作 者： Sanna Auer； Tiia Koho 等，坦佩 雷大学 诺如病毒(Noroviruses，NoV) 是引起人腹泻的一种病毒，可以通过污染的食物和水传播，并且能通过粪口途径人传人。由于缺乏适当的细胞培养系统和动物模型， NoV 的病毒样颗粒(VLPs)被广泛用于研究 NoV 的结构，宿主-细胞相互作用，并作为血清学诊断检测的工具。NoV 表面由 180个VP1蛋白组成，VP由S和P两个结构域， P颗粒是由12个P结构域二聚体组成的颗粒。(内容不够清晰) 研究人员利用带 His 标签的VLPs和P颗粒作为抗原，将其固 定在 Ni-NTA 生物传感器上，然后与病人血清样本中的 NoV抗体进行结合，再结合标记二抗，最后通过 DAB 与二抗的结合进行酶底物信号的放大。研究结果表明，浸入即读的检测方式使得 Octet@可用于临床样品(如唾液、尿液、全血和血清等)的检测，其灵敏度与 ELISA 几乎一样，但是，具备更宽的线性范围。同时，还能够极大地缩短了检测时间。总之，Octet@酶底物信号放大是一种非常有效的方法，可用于快速定量血清样本中的抗体。 AnalyticalBiochemistry 文章： Biolayer interferometry predicts ELISA performance of monoclonalantibody pairs for Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2. 作者： C.F.Markwalter； l.K. Jang 等，范德堡大学 Sandwich 法 ELISA 作为经典的体外诊断方法在疾病预测、筛选、检测与诊断中应用极其广泛。其中的一抗和二抗选择就非常重要。研究人员利用恶性疟疾的重要标志物 HRP2(Plasmodium falciparum histidine-rich protein 2)， 尝试开发和建立更灵敏的 ELISA 诊断方法。他们利用 Octet@技术分析了十几种不同的mAbs，找到高亲和力的抗体，并且获取了KD， kon 和 koff 等数据。 作者为了确定合适的一抗(捕获抗体)和二抗(检测抗体)并 对其进行配对，建立了以捕获抗体的动力学的参数作为横坐标，检测抗体的动力学参数作为纵坐标的分布图。气泡圆圈大小代表抗体对的 S/N(ELISA 结果的信噪比)，面积越大代表越好的抗体对。捕获抗体的 ka 值与 S/N 几乎没有相关性，而检测抗体的 ka 值越大，则 S/N 越好。相反，检测抗体的 kd没什么影响，而捕获抗体的kd越小，则 S/N 越好。这说明最佳的诊断抗体对往往是慢解离的捕获抗体和快结合的检测抗体。因此，作者指出直接利用 Octet@就可以快速筛选并预测合理的抗体对，可加快诊断抗体的研发工作。 捕获抗体与检测抗体动力学参数与信噪比的关系比较 病毒疫苗研究 病毒疫苗通常分为减毒活疫苗、灭活疫苗和 mRNA 疫苗， DNA疫苗。它们的制备方法不尽相同，效果和安全性也有所差异。在疫苗的生产的每个阶段，对样品进行快速检测分析是非常必要的。现行的传统方法耗时长，需要花费数个小时或者几天才能得到结果信息。Octet@对疫苗(蛋白， VLP 类疫苗)效力的快速分析给过程控制提供参考依据，提高了生产效率并减少时间和财力损失。 流感疫苗效价测定 文章： Application Note ： A fast and high precision influenza vaccine potency Assay. 作者： David Wheatley， Principal Scientist 等， Sartorius 流感疫苗效价测定的方法 将 California/7/2009(H1N1) 流感病毒抗体固化在三个不同批次的 Protein A 传感器上，每批重复测试五次。结果表明生物传感器的结合载量非常稳定。 Biosensors Average response % CV Lot 1 (n=5) 0.489 2.41 Lot 2 (n=5) 0.463 2.63 Lot 3 (n=5) 0.455 1.53 Lot to Lot 3.78 ProteinA传感器抗体结合载量的批间差异非常小(结合时间500秒) 100 病毒检测标准曲线的线性范围 SRID 是一种基于凝胶的常用流感病毒效价检测技术，易于使用且成本相对较低。 但是它的检测时间往往需要长达三天，并且数据分析结果的主观性较强。Octet@是一种速度更快的技术，样品处理更加轻松，仅需用样品稀释液进行简单 稀释即可。它通过实时的结合反应，直接分析疫苗样品本身的结合速率，无需借助其他辅助样品。从测定结果来看，Octet@分析产生的精确度和动态范围也明显优于 SRID。 Platform Assay time for 96-samples SRID Several days OctetR8 <180 min Octet°RH16 < 90 min OctetRH96 <20 min B/Massachusetts Octet°assay (ug/mL) SRID (ug/mL) Replicate (Conc. High Low Conc. Conc.High Low Conc. group avg %CV avg %CV A 723.65 821 658 8.84 711 792 620 8.04 B 664.18 753 589 7.97 697 850 554 13.20 737.58 796 686 5.21 697 802 538 10.04 单项免疫扩散 (SRID) 与 Octet@检测时间及数据比较 优势总结： ·快速有效的疫苗效价检测方法 ▪用Octet@进行病毒效价分析，整个过程<30分钟 ▪在疫苗生产过程控制管理中，可以抽样快速检测 ▪疫苗株的更换或者配方的改变不会影响设备或者实验方法，只需要重新定量即可 ▪制备过程中的粗样品和纯化的样品均可以进行直接检测，如重组血凝素，病毒样颗粒，活苗和弱毒苗 ( 特别是对于多价疫苗，Octet@可快速测定各组分的效价。 ) Science 文章： Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein Vaccine for Respiratory SyncytialVirus. 作者： Jason S.McLellan； Man Chen 等，美国国立卫生研究院 呼吸道合胞病毒 (Respiratory syncytial virus ， RSV) 引起的呼吸道疾病是1~12个月的婴幼儿的主要死因之一。目前并没有特别有效的疫苗来预防和治疗。研究人员通过对 RSV 的主要抗原之一 Fusion 蛋白(F蛋白)进行了结构设计和蛋白质工程改造，根据其表达量和稳定性，以及中和抗体表位的保守性构造了几个RSV F 突变体蛋白，作为 RSV 的亚单位疫苗。这些疫苗聚焦在抗原表位O上面，是潜在的 RSV 中和抗体的靶点，将不同的突变体疫苗免疫小鼠和猕猴后，血清中 均检测出高滴度的 RSV 中和抗体，通过 Octet@竞争实验表明，这些中和抗体是特异的结合设计的亚单位疫苗。为了定量化不同设计疫苗的效价情况，作者利用 Octet@将不同的突变体的 RSVF 蛋白抗原固定在 AR2G 传感器上，检测稀释后的免疫小鼠血清，通过结合信号的变化来反映抗体产生的滴度。Octet@可直接检测血清等复杂的粗样品，同时还能保证高灵敏度和特异性。 三个不同Ｆ 蛋白突变体亚单位疫苗 (postfusion F，DS，DS-Cav1)免疫的小鼠血清与固化在传感器上的三个亚单位疫苗的信号以及血清中加入其他突变体的信号(竞争实验) 随着 SARS-CoV-2 的全球性大流行，如何快速地设计、开发和生产有效的药物和疫苗进行疾病的治疗和预防就成为了当务之急。这就需要对病毒的致病机理在结构与分子水平上进行深入的研究，分析病毒蛋白与宿主受体蛋白，病毒核酸与聚合酶等相关作用机制，从而找到关键的"解密之匙"。 Octet@采用非标记检测技术，避免了传统标记方法带来的低通量，样品前处理繁琐、实验过程冗长及假阳性等问题，可以在短时间内实时提供高通量的生物分子相互作用信息，对分子间的静电作用、氢键、范德华力和疏水作用等典型的非共价结合过程进行精确快速地定量测定，这对药物及疫苗的基础研发来说至关重要。 Octet@通过浸入即读的方式，克服了流路系统带来的操作复杂、管路易堵塞、不适合粗样品、维护成本高等缺点，可以实现对各种样品类型的分子进行直接检测，无论纯化的抗体、蛋白、核酸、多肽、糖类，还是细胞上清、细菌裂解液、血清、发酵液等粗制样品，甚至高浓度的有机溶剂等都不受任何限 制。J。 Octet@的软硬件操作更简便快捷，维护更简单，成本更低，是各种病原微生物样品相互作用研究的最佳选择之一。 目前， Octet@分子相互作用分析仪在全球装机超过4200多台，国内拥有约400台，遍及国内外的各大科研机构、高校、医院和生物制药企业等，并发表有大量的文献，如 CellNature、Science 等。Octet@在抗体筛选和配对、蛋白结构功能、基因调控分析、药物研发、疫苗开发与生产等领域拥有绝对的优势，以优质的技术支持和售后服务受到广大用户的青睐和好评，已经成为生命科学研究和生物制药分析的必然选择。 Journal Year Title Author 1 Science 2020 Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation University of Texas at Austin 2 Science 2020 Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody rituximab Genentech Inc 3 Nature 2020 Structural insight into arenavirus replication machinery Institute of Microbiology， Chinese Academy of Sciences， Beijing， China 4 Cell 2020 Structure， Function， and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein University of Washington 5 Science 2020 Ahighly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS- CoV-2 and SARS-CoV The Scripps Research Institute， La Jolla 6 Cell 2020 Restricted Clonality and Limited Germinal Center Reentry Characterize Memory B Cell Reactivation by Boosting The Rockefeller University 7 Nature 2020 An open-source drug discovery platform enables ultra-largevirtual screens Har vard Medical School，Harvard University 8 Cell 2020 Structural Basis for Potent Neutralization of Betacoronaviruses by Single- domain Camelid Antibodies The University of Texas at Austin 9 Science 2020 A noncompeting pair of human neutralizing antibodies block COVID-19 virus binding to its receptorACE2 School of Basic Medical Sciences， Capital Medical University， Beijing 10 Cell 2020 Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high- throughput single-cell sequencing of convalescent patients B cells Peking University 11 Cell 2019 Convergent Structures Illuminate Features for Germline Antibody Binding and Pan-Lassa Virus Neutralization The Scripps Research Institute 12 Cell 2019 Antibody Lineages with Vaccine-Induced Antigen-Binding Hotspots Develop Broad HIVNeutralization NIH 13 Cell 2019 Human Antibodies that Slow Erythrocyte Invasion Potentiate Malaria-Neutralizing Antibodies University of Oxford 14 Cell 2019 Cryo-EM Structure of Chikungunya Virus in Complex with the Mxra8Receptor University of Washington 15 Cell 2019 Antibodies to a Conserved Influenza Head Interface Epitope Protect by anlgG Subtype-Dependent Mechanism Boston Children's Hospital， Harvard Medical School & Duke University 16 Cell 2019 A Site of Vulnerability on the Influenza Virus Hemagglutinin Head Domain TrimerInterface The Scripps ResearchInstitute & Vanderbilt University Medical Center 17 Cell 2019 Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus Institute for Research in Biomedicine， Bellinzona， Switzerland & University of Washington 18 Cell 2019 Unexpected Receptor Functional Mimicry Elucidates Activation ofCoronavirus Fusion University of Washington Journal Year Title Author 19 Science 2019 Targeted selection of HIV-specific antibody mutations by engineering B cellmaturation Duke University 20 Science 2019 Innate immune recognition of glycans targets HlV nanoparticle immunogensto germinal centers The Scripps Research Institute& MIT 21 Nature 2019 Immunization expands B cells specific to HIV-1V3 glycan in mice and macaques The Rockefeller University 22 Nature 2018 Neutralizing human antibodies prevent Zika virus replication and fetal diseasein mice Vanderbilt University MedicalCenter 23 Immunity 2018 Glycan Masking Focuses Immune Responses to the HIV-1CD4-Binding Site NIH and Enhances Elicitation ofVRC01-Class Precursor Antibodies 24 Cell 2018 An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor Genetech 25 Nature Communications 2018 Widespread anti-CRISPR proteins in virulent bacteriophages inhibit a rangeof Cas9 proteins Universite Laval 26 Nature Communications 2018 Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility Northwestern University 27 Cell Host & Microbe 2018 Human Cytomegalovirus Protein UL31Inhibits DNA Sensing of cGAS to Mediate Immune Evasion Wuhan Institute of Virology 28 Science 2018 Antihomotypic affinity maturation improves human B cell responses against a repetitive epitope German Cancer Research Institute 29 Nature Chemistry 2018 Ahuman MUTYH variant linking colonic polyposis to redox degradation of the [4Fe4S]2+cluster University of Southern California Norris 2018 Comprehensive Cancer Center 30 Nature Medicine A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure- based mechanism UCSF Diabetes Center University of California 31 Nature Communications 2018 Structure of a cleavage-independent HIV Env recapitulates the glycoprotein architecture of the native cleaved trimer The Scripps Research Institute 32 Immunity 2018 An Antibody Targeting the Fusion Machinery Neutralizes Dual-Tropic Infection and Defines a Site of Vulnerability on Epstein-Barr Virus Influenza Infection in Humans Induces Broadly Cross-Reactive and Protective Neuraminidase-Reactive Antibodies University of Washington 33 Cell 2018 University of Chicago 34 Nature Communications 2018 Rational design of a trispecific antibody targeting the HIV-1 Env with elevated anti-viral activity University of Maryland 35 Nature Communications 2018 HIV envelope V3 region mimic embodies key features of a broadly neutralizing antibodylineage epitope Harvard Medical School 36 Immunity 2018 Infants Infected with Respiratory Syncytial Virus Generate Potent Neutralizing Antibodies that Lack Somatic Hypermutation Geisel School of Medicine at Dartmouth Journal Year Title Author 37 Immunity 2018 Memory B Cells that Cross-React with Group 1 and Group 2 Influenza AViruses Are Abundant in Adult Human Repertoires Harvard Medical School 38 Immunity 2017 HIV Envelope Glycoform Heterogeneityand Localized Diversity Govern the Initiation and Maturation of a V2 Apex Broadly Neutralizing Antibody Lineage The Scripps ResearchInstitute 39 Cell 2017 2017 A glycerophospholipid-specific pocket in the RVFV class II fusion protein drives target membrane insertion Institut Pasteur，France 40 Cell Host & Microbe A Highly Pathogenic Avian H7N9 Influenza Virus Isolated from A Human Is Lethal in Some Ferrets Infected via Respiratory Droplets NIH 41 Nature 2017 Alveolar macrophages are critical for broadlyreactive antibody-mediated Icahn School of Medicine at Communications protection against influenza A virus in mice Mount Sinai 42 Immunity 2017 Glycans Function as Anchors for Antibodies and Help Drive HIV Broadly Neutralizing Antibody Development The Scripps Research Institute 43 Cell 2017 Non-neutralizing Antibodies Alter the Course of HIV-1 Infection In Vivo The Rockefeller University 44 Nature Biotechnology 2017 Computational design of trimeric influenza-neutralizing proteins targetingthe hemagglutinin receptor binding site University of Washington 45 Immunity 2017 Virus-like Particles Identify an HIVV1V2 Apex-Binding Neutralizing Antibody that Lacks a Protruding Loop NIH 46 Immunity 2017 Particulate Array of Well-Ordered HIV Clade C Env Trimers Elicits Neutralizing Antibodies that Display a Unique V2 Cap Approach Tumor and Cell Biology， Karolinska Institutet 47 cell 2017 Immunization-Elicited Broadly Protective Antibody Reveals Ebolavirus FusionLoop as a Site of Vulnerability University of Maryland 48 Immunity 2017 Glycine Substitution at Helix-to-Coil Transitions Facilitates the Structural Determination of a Stabilized Subtype C HIV Envelope Glycoprotein The Scripps ResearchInstitute 49 Cell 2017 Antibodies from a Human Survivor Define Sites of Vulnerability for Broad Protection against Ebolaviruses Albert Einstein College of Medicine 50 Sci.Transl.Med 2017 Mimicry of an HIV broadly neutralizing antibody epitope with a synthetic glycopeptide Duke University 51 Nature Communications 2017 Potent single-domain antibodies that arrest respiratory syncytial virus fusionprotein in its prefusion state Ghent University 52 Nature 2016 Structural basis of potent Zika-dengue virus antibody cross-neutralization Unite de Virologie Structurale，France 53 Sci.Transl. Med 2016 Initiation of immune tolerance-controlled HIV gp41 neutralizing B cell lineages Duke University 54 Nature Communications 2016 Human antibody 3E1 targets the HA stem region of H1N1 and H5N6 influenza A viruses National Centerfor Protein Science Shanghai Journal Year Title Author 55 Science 2016 CryoEM structure of a native， fully glycosylated and cleaved HIV-1envelopetrimer The Scripps Research Institute 56 Nature Medicine 2016 Influenza immunization elicits antibodies specific for an egg-adapted vaccinestrain Harvard Medical School 57 Cell 2016 Cross-Neutralizing and Protective Human Antibody Specificities to PoxvirusInfections VanderbiltVaccine Center 58 Cell 2016 Induction of HIV Neutralizing Antibody Lineages in Mice with Diverse Precursor Repertoires Boston Children's Hospital 59 Nature Communications 2016 A broadly neutralizing anti-influenza antibody reveals ongoing capacity of haemagglutinin-specific memory B cells to evolve Dana-Farber CancerInstitute， Harvard Medical School 60 Nature structural & 2016 Iterative structure-based improvement of a fusion-glycoprotein vaccine NIH molecular biology against RSV 61 Cell 2016 Structural Basis of Zika Virus-Specific Antibody Protection University of Washington 62 Nature 2016 Presenting native-like trimeric HIV-1 antigens with self-assembling The Scripps Research Institute Communications nanoparticles 63 Sci. Transl.Med 2016 Initiation of immune tolerance-controlled HIV gp41 neutralizing B cell lineages Duke University 64 Science 2016 Isolation of potent neutralizing antibodies from a survivor of the 2014 Ebola virus outbreak The Scripps Research Institute 65 Science 2016 Structural and molecular basis for Ebola virus neutralization by protective human antibodies NIH 66 Science 2016 Protective monotherapy against lethal Ebola virus infection by a potently neutralizing antibody Institute for Research in Biomedicine 67 Nature Communications 2016 Specifically modified Envimmunogens activate B-cell precursors of broadly neutralizing HIV-1 antibodies in transgenic mice Fred Hutchinson Cancer Research Center 68 Cell 2016 Cross-Reactive and Potent Neutralizing Antibody Responses in Human Vanderbilt University Survivors of Natural Ebolavirus Infection 69 Science 2015 A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen Crucell Vaccine Institute 70 Nature Immunology 2015 PARP9-DTX3L ubiquitin ligase targets host histone H2BJ and viral3C protease to enhance interferon signaling and control viral infection Washington University 71 Nature Communications 2015 A highly stable prefusion RSV F vaccine derived from structural analysis of the fusion mechanism JanssenInfectious Diseases and Vaccines，Holland 72 Cell 2015 Viral Receptor-Binding Site Antibodies with Diverse Germline HarvardMedical School Journal Year Title Author 73 Nature structural & molecular biology 2015 Crystal structure， conformational fixation and entry-related interactions ofmature ligand-free HIV-1 Env NIH 74 Nature Communications 2015 Evaluation of candidate vaccine approaches for MERS-CoV NIH 75 Cell 2015 Rational Design of an Epstein-BarrVirus Vaccine Targeting the Receptor- Binding Site NIH 76 Nature Medicine 2015 Hemagglutinin-stem nanoparticles generate heterosubtypic influenza protection NIH 77 Nature 2014 Structure-based Programming of Lymph Node Targeting in Molecular Vaccines 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influenza virus MRC National Institute for Medical Research， UK 86 Nature 2013 Coagulation factorXshields adenovirus type 5 from attack by natural FDAantibodies and complement 87 Nature 2013 Receptor binding by an H7N9 influenza virus fromhumans MRC National Institute for Medical Research， UK 88 Nature 2012 Cross-neutralization of influenza A virusesmediated by a single antibody loop The Scripps ResearchInstitute 89 Science 2011 A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2Influenza A Viruses The Scripps Research Institute 选择合适的 Octet@系统 Octet@ 系统家族可满足广泛的应用及工作流程需要，赛多利斯当地的销售人员可为您提供 Octet@详尽的信息，配合我们丰富的 Octet@ 应用方案数据库，选出适合您需要的系统。 OctetR2 系统2通道，科研型小分子和大分子表征 OctetR4系统4通道，自动化小分子和大分子表征/ Octet R8 系统8通道，自动化小分子和大分子表征 OctetRH16 系统16 通道， 高通量小分子和大分子表征 Octet@RH96 系统96通道，超高通量小分子和大分子表征 系统 系统 系统 系统 系统 应用小分子应用EP大分子-例如病毒、VPL、田纳米颗粒、细胞DNA、RNA、多肽、蛋白分析物田测量弱结合亲和力田测量强结合亲和力田EEE筛选应用-例如表位分选、解离速率排序抗体表征定量测定(替代ELISA)抗体效价测定分析能力和工作流程效率通量 评级 低 高 OctetR2 Octet@R4 Octet@R8 OctetRH16 Octet@RH96 系统 系统 系统 系统 系统 性能 最大同时读数 2 4 8 16 96 分子量检测限 150 Da 150 Da 150 Da 150 Da 150 Da 结合速率(k)范围(M1s) 101-107 101-10 101-10 101-107 101-107 解离速率(k.)范围(s)1 10--101 10--10 106-101 10-6-101 10--101 亲和力(K)范围 mM-pM mM-pM mM-pM mM-pM mM-pM 样品蒸发控制 否 否 是 否 否 最小样品体积 200 pL 200 pL 200 pL 40 pL* 40 pL* 数据采集频率(Hz) 2， 5， 10 2， 5， 10 2， 5，10 2， 5， 10 0.3，0.6，2，5，10 规格 光谱仪数量 2 4 8 16 16 温度控制 15-40°C 15-40°C 15-40°C 环境温度+4-40℃ 环境温度+4-40℃ 微孔板位置 1(96孔) 1(96孔) 1(96孔) 2 (96或384孔) 2(96或384孔) 自动化整合 否 否 否 是 是 尺寸 尺寸高x宽x深(cm) 49x56x46 49x56x46 49x56x46 77×80×80 77×80×80 重量 (kg) 32.7 32.7 32.7 68.2 90.7 *在384孔带有倾斜底部的微孔板中(Sartorius， 零件号18-5080) 销售与服务联系方式 更多联系信息，请访问 www.sartorius.com.cn 赛多利斯(上海)贸易有限公司 邮箱lab.cn@sartorius.com 服务热线 400 920 9889|800 820 9889 上海 上海市浦东新区盛荣路 388 弄百佳通产业园3号楼，7-11 层，200120 电话+86 21 6066 6100 北京 北京市顺义区空港工业区B 区裕安路 33号， 101300 电话 +86 10 8042 6300 广州 广州市越秀区水荫路 117号 1105 单元， 510075 电话+8620 37617284 ( 技木规格如有变更，恕不另行通知。 ) ( 赛多利斯保留最终解释权和修改权。 ) ( 版本01|2022 ) 波长 (nm) 医学论文预印本平台 medRxiv 近期发布了接种科兴新冠疫苗的临床数据报告《A third dose of inactivated vaccine augments the potency, breadth, and duration of anamnestic responses against SARS-CoV-2》[1]。报告分享这篇报告由中科院生物物理所王祥喜团队与复旦大学、中国食品药品检定研究院、北京大学、科兴生物、广东省疾控中心、广州实验室和浙江省疾控中心共同完成。报告剖析对比了来自3剂量接种者（3剂苗）、2剂量接种者和康复者的抗体免疫原性图谱，发现接种3剂苗有更好的中和突变体新冠病毒（VOCs，variants of concerns）广度，并快速引发B细胞记忆能力和更持久的体液应答，得出了注射第三剂灭活病毒疫苗可以增强免疫反应的结论。本篇文章的关键在于解析这种现象的分子机制，对上百种SARS-CoV-2中和抗体的构效关系进行了分析，揭示了VOCs的广谱中和抗体分子原理。本次研究对象包括22名新冠肺炎康复者、6名健康人和38名接种过2剂或3剂科兴新冠疫苗者，年龄16-69岁不等，中位数33岁。抗体滴度和广谱中和性第二次注射科兴疫苗6个月后，中和抗体水平GMT(PRNT50)降至7；第三次注射后，中和抗体水平的最大峰值在177，180天后仍有60，相当于第二次注射后的峰值。3剂苗引起的抗体中和水平更高病毒是不断突变的，疫苗产生抗体对突变体的中和能力下降是必然的，比如2剂苗对德尔塔病毒（B.1.617）的中和能力下降3.7倍，而3剂苗只下降了2.3倍，说明3剂苗能更好地抵抗病毒的突变。3剂苗对突变体病毒的中和能力下降最小3剂苗中和抗体的鉴定首先，用流式细胞术（赛多利斯也有流式细胞仪哦，联系我们获取更多产品信息资料）测定发现能产生S蛋白抗体的记忆B细胞比例，3剂苗要明显大于2剂苗，而且3剂苗的S蛋白记忆B细胞的克隆形成能力比2剂苗强。然后通过单个B细胞测序和分离技术，获得了3剂苗的主要抗体基因型，并从3剂苗人中提取了48个单克隆抗体。随后使用Octet®分子互作分析系统和ELISA检测了这些抗体与5种新冠病毒突变株的亲和力，发现这些抗体都可以结合这些突变株，只是针对NTD结构域的抗体对不同突变株的亲和力差异比较大，这个可能和NTD突变率关系较大。Octet® Red 96e，用proteinA传感器固化抗体，与不同突变株RBD进行结合解离的部分数据。中和抗体构效关系研究构建了已知序列的171株抗体，分析了它们在RBD上的结合位点，总共分为I-VI结合部位。继续用Octet®和ELISA检测这些抗体的亲和力，发现识别IV,V,VI部位的抗体对突变敏感度较低。上图为RBD蛋白抗体结合位点分类，下图为Octet®检测的抗体和不同突变体RBD的亲和力结果。Octet®部分结果显示，结合I位点的CB6抗体与P.1以及B1.351无法结合，而结合IV位点的S309抗体与各种突变株都可以结合。3剂苗对突变体的中和能力更强，可能是因为引发针对IV-VI部位的抗体比率增加。而且发现3剂苗（Late time point）的单克隆亲和力总体高于2剂苗(Early time point)，并且体细胞高频突变率（SHM）与亲和力正相关。3剂苗（Late time point）的平均单克隆亲和力KD < 1 nM，远远高于2剂苗亲和力KD（2.31 nM-7.75 nM）本文同时用ELISA和Octet®检测亲和力，因为越来越多的客户发现光做ELISA是不够的，与ELISA相比Octet®的优势在于：- 可以获得KD/kon/koff等动力学常数，对反应更加定量化- 防止疏水包被导致的抗原表位丧失- 检测灵敏度更高，可以很好区分 1 nM~1 pM的亲和力- 没有洗涤步骤，可以检测解离快的弱结合- 自动化，节约大量人工成本总结这篇文章放了10页的Octet®原始数据，每页有50个抗体反应，每个抗体4个浓度，共有2000对反应。与其他类似仪器相比，通量更高，使用更便捷的Octet®优势更大。这么多Octet®数据告诉您速度去预约第三剂疫苗！文末彩蛋Download《生物层干涉技术应用文集——病毒学基础研究及药物研发》本文集通过对 Octet® 在病毒研究中分子结合动力学相关应用的梳理和分析，希望能够给广大科研工作者在病毒致病机理、病毒药物发现、病毒诊断检测、病毒疫苗研究等不同领域带来启示和帮助，促进我国病毒学、微生物学、免疫学等相关领域的发展。-参考文献-https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2021.09.02.21261735v1