食用油中辣椒素类成分检测方案(液相色谱仪)

3种辣椒素类化合物加标回收率 应用简报 Agilent法医毒理学Trusted Answers 采用 Agilent 6470三重四极杆液质联用系统测定食用油中的辣椒素类成分 蒋畅，吕磊，胡培斌 安捷伦科技(中国)有限公司 本文采用 Agilent 1290 Infinity ll 液相色谱和6470三重四极杆液质联用系统测定食用油中的3种辣椒素类成分。该方法与中国食品药品检定研究院颁布的 BJS 201801《食用油脂中辣椒素的测定》保持一致，并对样品前处理过程进行了优化，简化了操作步骤。所考察的3种辣椒素类成分的检测限为5-10 pg/mL， 完全满足原补充检验标准中的检测限要求。 “地沟油”泛指各种劣质油脂，包括沾水油、煎炸老油、劣质动物内脏或皮脂的炼制油、食品及相关企业产生的废弃油脂等，其中来自餐饮业的沿水油是地沟油的主要来源之一。 辣椒是餐饮业中用量较大的调料，使用范围遍布全国各地。辣椒中的辣味成分主要是辣椒碱，其具有脂溶性强、稳定性好、沸点高等特点。研究发现，天然辣椒碱由14种辣椒素同系物组成，其中辣椒素和二氢辣椒素的总含量占辣椒碱的90%以上。合成辣椒素由人工合成得到，由于其价格和辣度与天然辣椒素相比具有绝对优势，因此广泛应用于食品添加剂和餐饮行业中。 通常情况下，正常的食用油基本不含辣椒碱，而接触过辣椒的餐厨废弃油脂中难以避免地含有这类成分，而目前的地沟油加工工艺很难完全去除脂溶性强的辣椒碱物质。因此可将含量较高的天然辣椒素、、.二氢辣椒素和合成辣椒素(结构式如图1所示)作为鉴别餐饮废弃油脂的特征指标。 2012年8月，由大连化物所和重庆公安局起草的《食用植物油中辣椒碱成分的液相色谱-质谱检测方法及其在“地沟油”识别中的应用》[1为质谱鉴别地沟油开创了先河。其后中国食品药品检定研究院将《食用油脂中辣椒素的测定 BJS201801》2作为食用油检测过程中的补充检验方法。这两项标准均以天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素作为鉴别地沟油的特征指标。 本文使用 Agilent 1290 Infinity ll液相系统和6470三重四极杆系统对3种特征指标进行含量测定，并建立了相应的样品前处理流程。 图1.3种辣椒素类化合物的结构式 实验部分 试剂和样品 所有标准品均购自 Accustandards 公司 (New Haven， CT， USA)。质谱所用纯甲酸和乙腈购自 Merck 公司 (Kenilworth， USA)。水由Milli-Q超纯水系统制得。 仪器和设备 Agilent 1290 Infinity ll 液相色谱系统，配备如下安捷伦组件：G7120A二元泵、G7167B自动液体进样器、G7116B柱温箱和G7117B二极管阵列检测器。 所用质谱仪为 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统。 标样前处理 用甲醇将3种标准品的混合溶液稀释成 5 pg/mL-100ng/mL 的校准标样，储存在棕色样品瓶中。 样品前处理 准确称取 0.5g样品加入 10 mL 具塞塑料试管中，加入1mL二氯甲烷，再加入3mL 2%氢氧化钠溶液；涡旋提取10 min，以4000 r/min 离心 10 min， 取上层水相；再用3mL2%氢氧化钠溶液将残留有机相重复提取一次，合并水相。 Agilent Bond Elut Plexa PAX 小柱预先用 3 mL 乙腈淋洗3次，再用3mL纯水淋洗2次进行平衡；然后将上述水相提取液加入小柱，控制流速速每秒1-2滴，待全部溶液通过 SPE 小柱后，以3mL超纯水淋洗2次，弃去流出液；最终以3mL的5%甲酸乙腈洗脱2次。 用50℃氮气将乙腈洗脱液吹至近干，用0.5mL甲醇溶解后，通过微孔滤膜(0.22pm， 有机相)进行过滤。并将滤液置于样品瓶内衬管中，以供LC-MS/MS 测定。 液相条件 色谱柱： Agilent Eclipse Plus-C18，2.1x 50 mm， 1.8 pm 柱温： 40°C 进样体积： 2pL 流动相： A)0.1%甲酸水溶液 B) 0.1%甲酸乙腈溶液 运行时间： 10 min 流速： 0.3 mL/min 梯度程序： T (min) B(%) 0 4 6 质谱条件 鞘气温度： 400°℃ 鞘气流速：12 L/min 干燥气温度： 300°C 干燥气流速： 8L/min 雾化器压力： 40 psi 毛细管电压： 3000V 喷嘴电压： OV Delta EMV： 300V MRM 离子对： 如表1 表1.用于3种辣椒素类化合物的 MRM 离子对方法 化合物名称 母离子 子离子 碎裂电压(V) 碰撞能量(eV) CAV 极性 二氢 辣椒素 308.1 184.2 90 8 4 正 308.1 137.1 90 20 4 正 天然 辣椒素 306.2 182.2 80 8 4 正 306.2 137.2 80 24 4 正 合成 辣椒素 294.2 170.2 90 8 4 正 294.2 137.1 90 12 4 正 分离效果 本方法可在6分钟内完成3种辣椒素类化合物的 LC-MS/MS分析。天然辣椒素和合成辣椒素的结构类似，极性相似，出峰时间一致。 合成辣椒素 图2.3种辣椒素类化合物的 MRM 色谱图(1 ng/mL) 检测限和线性范围 使用 Agilent 6470 三重四极杆系统可以对3种辣椒素类化合物进行超低浓度的检测，该方法仅为 BJS 201801《食用油脂中辣椒素的测定》补充检验标准检测限的1/20-1/10，详见表2. 表2.3种辣椒素类化合物的检测限和定量限 化合物名称 检测限 定量限 天然辣椒素 5 pg/mL 10 pg/mL 二氢辣椒素 5 pg/mL 10 pg/mL 合成辣椒素 2 pg/mL 5 pg/mL 图3为3种辣椒素类化合物的线性范围，每种化合物均采用多个浓度级别。每个级别下重复进样3次，浓度范围为 5 pg/mL-100 ng/mL， 涵盖四个数量级，完全满足原标准中0.1-100 ng/mL的要求。 x106 合成辣椒素 y=30234.641902*X +0.000000E+000 丁TTTTTTTTTT 51015202530 35 40 45 50 556065707580 85 9095100105 浓度 (ng/mL) 图3.3种辣椒素类化合物的标准曲线和线性范围 加标回收率测试 在空白样品中加入1 ng/mL 和 10 ng/mL 混标溶液，经过前处理后计算其回收率，结果如图4所示。 图4.3种辣椒素化合物的加标回收率 实际样品检测 检测样品均为餐饮调和油，购于成都市食品批发市场，包含8个批次不同品牌的样品。检测结果如表3所列。 样品 编号 合成辣椒素 (ng/mL) 天然辣椒素 (ng/mL) 二氢辣椒素 (ng/mL) 总计 (pg/kg) 1 未检出 未检出 未检出 未检出 2 未检出 0.04 0.03 0.06 3 未检出 未检出 未检出 未检出 4 未检出 0.02 0.02 0.04 5 未检出 0.09 0.04 0.13 6 未检出 0.16 0.11 0.27 7 未检出 0.05 0.04 0.09 8 未检出 0.02 0.02 0.03 由上表可知，8个品牌样品中有2个未检出任何信号，6个品牌样品中含有少量辣椒素类成分。但根据 BJS 201801《食用油脂中辣椒素的测定》补充检验标准的规定，所测定的样品中辣椒素(合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素)总含量大于或等于1.0 pg/kg 时，才表明该油脂样品可能有异常，存在使用餐厨回收油脂的可能。这里所有所品中辣椒素的总含量均低于 1.0 pg/kg，因此它们均符合标准要求。 本文使用 Agilent 1290 Infinityll 液相色谱和6470三重四极杆液质联用系统对食用油中的3种辣椒素类化合物进行了测定。UHPLC 色谱分析只需6分钟，灵敏度是 BJS 201801《食用油脂中辣椒素的测定》补充检验标准方法的10-20倍。并对样品前处理方法进行了优化，简化了操作步骤，完全能够满足实际样品的测试需求。 1.1卫生部办公厅关于通报“地沟油”筛查方法的函(卫办监督函[2012]878号)第2部分.食用植物油中辣椒碱成分的液相色谱-质谱检测方法及其在“地沟油”识别中的应用 2..重庆市公安局物证鉴定中心.食用油脂中辣椒素的测定 BJS201801 www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) 5994-1165ZHCN 本文采用 Agilent 1290 Infinity Ⅱ 液相色谱和 6470 三重四极杆液质联用系统测定食用油中的 3 种辣椒素类成分。该方法与中国食品药品检定研究院颁布的 BJS 201801《食用油脂中辣椒素的测定》保持一致，并对样品前处理过程进行了优化，简化了操作步骤。所考察的 3 种辣椒素类成分的检测限为 5–10 pg/mL，完全满足原补充检验标准中的检测限要求。