玉米和花生基质中真菌毒素检测方案(液质联用仪)

应用简报 Agilent食品检测与农业Trusted Answers 使用 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统分析食品基质中的真菌毒素 图1.集成到液相色谱堆栈的 Agilent Ultivo Theresa Sosienskil，Dan-Hui Dorothy Yang，Mark Sartain1，Christian Hegmanns，Joni Stevens 安捷伦科技有限公司Santa Clara， CA ( 安捷伦科技有限公司 Waldbronn， Germany ) 本应用简报介绍了一种高灵敏度和高精度方法，使用 Agilent Ultivo 三重四极杆质谱仪分析玉米和花生基质中的12种真菌毒素，以及黑胡椒基质中的5种真菌毒素。Ultivo LC/MS 专为节省实验室空间，同时保持高通量分析所需的性能而设计。所有真菌毒素均可在低于欧盟委员会法规 (EC) No. 1881/2006 和 No. 105/2010 规定的每种基质最高浓度下定量。在 Ultivo 系统上获得了优异的方法精度，最低定量限下的相对标准偏差 (%RSD)<10%。将基质干扰净化、色谱分析和新开发的三重四极杆相结合，可灵敏、精确地检测真菌毒素。 前言 真菌毒素是由各种作物上生长的真菌产生的。在一定浓度和组合情况下，人类和牲畜可通过食用受污染的作物而受到真菌毒素的危害；因此，需要对食品中的真菌毒素含量进行监管，以最大程度减小摄入风险。为确保有害浓度的真菌毒素不进入食品供应，监管机构已确定最高浓度(ML)，从某些婴儿食品中的 0.1 ppb 到某些动物饲料中的 ppm 级水平。很有必要对各种食品基质中低于 ML 浓度的真菌毒素含量进行准确定量分析，因为每种基质组成都会造成不同的挑战。 Agilent Ultivo 三重四极杆 LC/MS 专门设计用于解决环境和食品安全分析实验室所面临的众多挑战。 Ultivo 采用的创新技术有助于减小其总体占用面积，同时性能可与传统系统相媲美(图1)。 Cyclone lonGuide 气旋离子导轨、Vortex CollisionCell 涡流碰撞室和双曲面四极杆等创新产品，能最大程度提高小体积仪器的定量分析性能。这些创新增强了仪器的可靠性和稳定性，从而延长了正常运行时间。VacShield真空盾和轻松更换检测器组件减少了系统维护所需的时间和专业知识，使非专业质谱用户也可轻松操作和维护。Agilent MassHunter 软件套装简化了数据采集、方法设置、数据分析和报告。该软件缩短了从采集到报告的时间，从而提高了实验室分析效率和可信度。 本应用简报展示了使用新款 Ultivo 三重四极杆 LC/MS 对三种常见受监管食品中最多12种受监管真菌毒素进行灵敏而精确的定量分析。 实验部分 试剂与化学品 本应用中使用的所有试剂均为 HPLC或 LC/MS级。乙腈购自 Honeywell(Morristown， NJ， USA)， 超纯水产自配有 LC-Pak Polisher 和 0.22 um 膜式终端过滤器滤芯的 Milli-Q Integral 水纯化系统(EMD Millipore， Billerica， MA， USA)。甲酸(FA) 和甲酸铵购自 Fluka (Sigma-AldrichCorp.， St. Louis， MO， USA)， 氟化铵购自Aldrich (Sigma-Aldrich Corp.， St. Louis，MO， USA)。化学标准品购自 Sigma-Aldrich 或 Cayman Chemical。 样品前处理 玉米粉、花生和黑胡椒碎购自当地杂货店。称取5g玉米粉、5g花生碎(在搅拌器中磨碎，冷冻待分析)或2g黑胡椒碎，置于50mL 聚丙烯管中，用10 mL乙腈和10 mL 含 0.2% FA 的超纯水进行萃取，然后使用旋转摇床 (Heidolph Hei-MIX Multi reax， 545-10000-00)振摇30分钟。将 Agilent QuEChERS EN 萃取盐(部件号5982-5650)加入萃取物中，将试管再振摇2分钟，然后以4500 rpm 的转速离心5分钟 (Sorvall Heraeus， Labofuge400K)。使用安捷伦通用分散式固相萃取 试剂盒(部件号5982-0029)对黑胡椒萃取物进行额外的净化步骤。然后，用0.4mL 超纯水稀释1.6mL所有萃取物，并用 Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱(部件号5190-1003)进行净化。在分析之前，按照萃取物/超纯水30：70 的比例对加标黑胡椒萃取液进行稀释。图2显示了样品前处理的流程图。 ( 仪器 ) ( Agilent 1290 Infinity II UHPLC ) ( Agilent 1290 Infinity 高速泵 (G7120A) ) ( Agilent 1290 Infinity II Multisampler， 配备冷却装置(G7167B) ) ( Agilent 129 0 Infinity ll 高容量柱温箱 (G7116B) ) ( Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统 安捷伦喷射流电喷雾离子源 ) 方法 ( 表1汇总了 Agilent 129 0 Infinity I I UHPLC条件。表2汇总了 Ultivo 三重四极杆参数和安捷伦喷射流 ESI 离子源参数。采用正离子模式和动态多反应监测 (dMRM) 进行分析。采 用 具有 Quant-My-Way 功能的Agilent MassHunter定量分析软件 B.09 对数据进行评估。 ) 表 1. Agilent 1290 Infinity II UHPLC 参数 参数 值 色谱柱 Agilent Eclipse Plus C18 3.0×150 mm，1.8 pm(部件号959759-302) 柱温 45°C 进样量 2pL玉米、花生， 10 pL黑胡椒 流动相 A) 0.5 mmol/L 氟化铵+5 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸的水溶液B) 0.5 mmol/L 氟化铵+5 mmol/L 甲酸铵+0.1%甲酸的甲醇溶液 流速 0.45 mL/min 梯度 时间 %B 300.5 307.5 1009.0 100 9.1 30 停止时间 9.1 min 后运行时间 1.9 min 表2.Agilent Ultivo 三重四极杆和安捷伦喷射流离子源参数 参数 值 干燥气温度 250°℃ 干燥气流速 8 L/min 鞘气温度 350°℃ 鞘气流速 12 L/min 雾化器压力 30 psi 毛细管电压 3300V(+) 喷嘴电压 0V(+) 循环时间 500 ms 真菌毒素最大监管浓度 真菌毒素有多种监管浓度，具体取决于特定真菌毒素、被分析基质、监管机构和目标消费者。本研究使用欧盟法规No. 1881/2006和 No. 105/2010 作为基准。因为与其他地区监管机构相比，欧盟规定的真菌毒素最高浓度(ML)通常最低。非监管化合物或不包括在基质中，或根据表4中确定的当前关注浓度进行估算。 化合物 母离子(m/z) 子离子(m/z) RT(min) RT窗口(min) 碎裂电压(V) CE(V) 极性 黄曲霉毒素B1 (AB1) 313.3 285.1 5.9 1 190 20 正 黄曲霉毒素 B1 (AB1) 313.3 241.1 5.9 1 190 40 正 黄曲霉毒素 B2(AB2) 315.1 287.1 5.7 1 190 24 正 黄曲霉毒素 B2 (AB2) 315.1 259.1 5.7 1 190 28 正 黄曲霉毒素 G1 (AG1) 329.1 311.1 5.3 1 180 20 正 黄曲霉毒素 G1 (AG1) 329.1 243.1 5.3 1 180 28 正 黄曲霉毒素 G2 (AG2) 331.1 313.1 5.1 1 190 24 正 黄曲霉毒素 G2 (AG2) 331.1 115 5.1 1 190 80 正 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON) 297.1 249.2 3.0 1 120 4 正 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON) 297.1 77 3.0 1 120 80 正 伏马菌素 B1 (FB1) 722.4 352.3 6.6 1 240 36 正 伏马菌素 B1 (FB1) 722.4 334.3 6.6 1 240 40 正 伏马马素B2 (FB2) 706.4 336.3 7.4 1 240 36 正 伏马菌素 B2 (FB2) 706.4 318.4 7.4 1 240 40 正 伏马菌素 B3 (FB3) 706.4 336.3 7.0 1 240 36 正 伏马马素 B3 (FB3) 706.4 318.4 7.0 1 240 36 正 HT-2毒素(HT-2) 442.2 263.2 6.8 1 120 4 正 HT-2毒素(HT-2) 442.2 215.1 6.8 1 120 4 正 赭曲霉毒素A (OTA) 404.1 239 7.6 1 140 20 正 赭曲霉毒素A (OTA) 404.1 221 7.6 1 140 36 正 T-2毒素(T-2) 484.2 215.2 7.3 1 140 12 正 T-2毒素(T-2) 484.2 185.1 7.3 1 140 4 正 玉米赤霉烯酮(ZEA) 319.2 301.2 7.7 1 120 4 正 玉米赤霉烯酮(ZEA) 319.2 185.1 7.7 1 120 24 正 表4.本研究中真菌毒素的 ML。采用欧盟法规指令 No. 1881/2006和 No. 105/2010 作为对照。本研究中所有的规定 ML均小于等于EU ML 真菌毒素 欧盟真菌毒素ML12.3 本研究使用的指定 ML 玉米(ppb) 花生(ppb) 黑胡椒(ppb) 玉米和花生(ppb) 黑胡椒(ppb) 黄曲霉毒素 B1 2 2 5 2 5 黄曲霉毒素 B2 黄曲霉毒素总和：4ppb 黄曲霉毒素总和：4 ppb 黄曲霉毒素总和： 10 ppb 2 5 黄曲霉毒素 G1 2 5 黄曲霉毒素 G2 2 5 赭曲霉毒素A 3 无 15 3 15 伏马菌素B1 B1 和 B2总和： 无 无 500 不包含 无 500 不包含 伏马菌素 B2 1000 ppb 伏马菌素B3 无 无 无 500 不包含 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 750 无 无 75 不包含 玉米赤霉烯酮 100 无 无 100 不包含 T-2毒素 无 无 无 100 不包含 HT-2毒素 无 无 无 500 不包含 该方法的萃取流程简单高效。AgilentCaptiva EMR-Lipid 试是盒提供一个快速步骤，可将基质组分与目标化合物完全分离。该方法证明了每种基质中所有化合物都有良好回收率，每种化合物在 ML 下的回收率均达到60%-110%(表5)。 表5.研究玉米、花生和黑胡椒基质中ML下的每种真菌毒素的回收率(%)。在 ML下评估伏马菌素化合物 真菌毒素 真菌毒素回收率(%) 玉米 花生 黑胡椒 黄曲霉毒素B1 107 105 90 黄曲霉毒素 B2 110 109 97 黄曲霉毒素 G1 109 108 102 黄曲霉毒素 G2 110 96 104 赭曲霉毒素A 83 83 109 伏马菌素B1 60 65 - 伏马菌素B2 67 77 伏马菌素 B3 90 61 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 111 72 玉米赤霉烯酮 98 90 - T-2毒素 105 104 一 HT-2毒素 108 102 方法灵敏度 图3显示了使用本方法分析的12种真菌毒素具有优异的信号响应，展示了玉米基质中在 ML 下的色谱图。评估了浓度范围从指定 ML的1/20到指定ML 10倍的真菌毒素标准品。将八种浓度加标至基质萃取物中，进行定量限 (LOQ) 和%RSD 分析。信号响应的增强可使每种基质中的大多数真菌毒素达到指定 ML 1/20 的定量限。图4显示所有真菌毒素的 LOQ至少为指定 ML 的1/5。 LOQ定义为六次重复进样中有四次精度为80%-120%，信噪比(S/N)大于10。 方法精度和线性 14 在每种基质中研究的所有化合物均获得了出色的精度。图5显示了在每种基质中的LOQ下六次重复进样的真菌毒素%RSD。所有化合物在每种基质中的 %RSD 均小于10%，多数化合物的 %RSD 小于 5%。在玉米和花生基质中以200ppt、在黑胡椒基质中以500 ppt 重复进样黄曲霉毒素B1((相当于低于 ML 的10倍)的放大视图中，突出显示了该方法的出色精度(图6)。 图5.真菌毒素在所有三种基质中均获得了优异的精度， LOQ下所有%RSD<10% 图6.所有基质中浓度为 ML 1/10 的黄曲霉毒素 B1 (200 ppt 或 500ppt) 的六次重复进样，表现出优异精度 所有化合物均表现出优异的线性。对每种化合物分析六至八个校准浓度，范围为ML的1/20至10倍，结果证明所有基质中所有化合物的R²值≥0.99。图7展示了花生基质中六种选定化合物优异线性的示例。 ×104 ×104 浓度(ng/g) 图7.花生基质中选定化合物的校准曲线。线性拟合，无需加权。箭头表示ML ( A gi l e nt U lti vo 三重四极杆 LC/M S 是 一 款创新质谱仪，可以最大程度降低对实验室 工作空间的需求，还可减少维护挑战，使 高通量实验室获得高效工作环境。 50 U ltivo 是一款体积小而功能强大的工具，能够对多种食品基质中远低于规定 ML 的常见受 监管真菌毒素进行准确而灵敏的检测。Agilent MassHunter 软件提供了一种采集和报告 LC/MS 数据简便易用的一体式 工具。 ) ( 1. B ennett， J . W.；Klich， M. Mycotoxins. Clinical Microbiology Reviews 2 003， 16(3)，497-516.2003 ) 2. ( Commission Regulation (EC) No1881/2006. Setting maximum levels for certain contaminants infoodstuffs. Official Journal of the European Union， 19 December 2006， L 364/5-24 ) 3. ( Commission Regulation (EU) No105/2010. Amending Regulation (EC)No 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards ochratoxin A. Official Journal of th e European Union， 5 February 2010， L35/7-8 ) 4. Determination of Mycotoxins in Peanuts with Enhanced MatrixRemoval-Lipid by LC/MS/MS(利用增强型脂质去除产品 EMR-Lipid对花生中的真菌毒素进行 LC/MS/MS测定)，安捷伦科技公司应用简报， 出版号5991-7381 本应用简报介绍了一种高灵敏度和高精度方法，使用 Agilent Ultivo 三重四极杆质谱仪分析玉米和花生基质中的 12 种真菌毒素，以及黑胡椒基质中的 5 种真菌毒素。Ultivo LC/MS 专为节省实验室空间，同时保持高通量分析所需的性能而设计。所有真菌毒素均可在低于欧盟委员会法规 (EC) No. 1881/2006 和 No. 105/2010 规定的每种基质最高浓度下定量。在 Ultivo 系统上获得了优异的方法精度，最低定量限下的相对标准偏差 (%RSD) < 10%。将基质干扰净化、色谱分析和新开发的三重四极杆相结合，可灵敏、精确地检测真菌毒素。