谷物中黄曲霉毒素检测方案(液相色谱仪)

依据 GB 5009.22-2016 使用 Agilent 1260Infinity ll 液相色谱和柱后光化学衍生法测定谷物中的黄曲霉毒素 肖尧，李功恒 在这篇应用简报中，我们依据国标 GB 5009.22-2016 开发出一种使用液相色谱-柱后光化学衍生的黄曲霉毒素分析方法。对检测限(LOD)、定量限(LOQ)、重现性、回收率等方面进行了方法学考察，并对谷物样品进行了检测。 与国标中其它的衍生检测方法相比，使用光化学衍生法具有操作简便、设备使用维护成本低且无需使用腐蚀性试剂等诸多优势，可以作为实验室分析黄曲霉毒素的优选方法。使用 Agilent 1260 Infinity ⅡI液相色谱系统以及柱后光化学衍生装置分析四种黄曲霉毒素 (G2、G1、B2和B1)所得的结果表明，该方法的分离度和灵敏度均满足国标中相应的要求，适用于检测谷物中的黄曲霉毒素。 前言 黄曲霉毒素是一种由真菌产生的致癌物质。真菌在合适的温度和湿度条件下会在土壤、谷物、坚果或腐烂的植物中生长。自然界中自然产生的黄曲霉毒素至少有14种之多，其中毒性最大的是黄曲霉毒素B1。因此，许多国家和地区的监管机构都对食物中黄曲霉毒素B1的含量制定了严格的规定，并且通常同时对毒性比B1略小的其它三种黄曲霉毒素 B2、G1和G2的含量也做出相应规定。 现行国标 GB5009.22-2016中规定了针对四种黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的检测方法及要求，其中涉及的检测方法有液质联用法、液相色谱法和酶联免疫法等。在诸多方法中，液相色谱-荧光检测法以其操作简便、仪器通用性强、灵敏度高等优势，成为大多数实验室用于黄曲霉毒素分析的首选方法。但是由于某些黄曲霉毒素在含水流动相中会发生荧光淬灭，因此需要采取合适的衍生技术将它们衍生为不会淬灭的形态。 目前国标中推荐的衍生方法有柱前衍生、柱后光化学衍生、柱后电化学衍生和柱后碘、溴试剂衍生法。其中，柱前衍生法需要对剧毒样品进行大量手工操作，提高了操作人员的风险；柱后电化学衍生法需要使用含有溴化钾及硝酸的流动相，对仪器损害较大；柱后碘、溴衍生需要配制专门的衍生试剂及昂贵的衍生设备，分析成本较高；而柱后光化学衍生方法则可以很大程度上避免上述方法带来的问题，实现简便、高效、低成本的黄曲霉毒素分析。 在这篇应用简报中，我们依据 GB 5009.22-2016， 采用 Agilent1260 Infinity Ⅱl四元泵液相色谱系统，开发出一种用于分析黄曲霉毒素 B1、B2、G1和G2的快速灵敏的柱后光化学衍生-荧光检测方法。该方法的定量限和检测限完全满足现行国标的要求。 试剂和样品 甲醇和乙腈为 HPLC 级， 购于迪马公司；所用实验用水为通过美国 Millipore 公司 MilliQ 超纯水制备的超纯水。 ( 黄曲霉毒素标准溶液(B1、B2、G1、G2混标溶解于乙腈中， 其中B1和G1的浓度分别为 1.0 mg/L， B2 和 G2 的浓度分别为0.3mg/ L ) 购于上海安谱实验科技股份有限公司。 ) 大米样品由安捷伦合作客户实验室提供并按照国标中相应的方法进行样品前处理。 仪器和设备 采用Agilent Infinity Lab 1260Ⅱ液相色谱系统，该系统配备如下安捷伦模块：四元泵(部件号 G7111B)、自动进样器(部件号 G7129C)、多功能柱温箱(配备标准流速预热器，部件号 G7116A)、荧光检测器(8uL流通池，部件号G7121A)，并配备忠测 ZW-01型柱后光化学衍生器(高流速配置，购于1成都忠测科技有限公司)。 色谱柱选用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC C18 (4.6×150 mm， 4pm， 部件号693970-902)。 标准品配制 取黄曲霉毒素标准溶液 500 uL 置于5mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为工作液；然后分别准确移取工作液10、50、200、500、1000、2000、4000 uL 置于 10 mL容量瓶中，前6个浓度点用初始流动相(水：甲醇：乙腈=68：16：16)定容至刻度，最高浓度点则用水定容至刻度；得到包含浓度分别为0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL 的黄曲霉毒素B1和G1以及浓度分别为0.03、0.15、0.6、1.5、3.0、6.0、12 ng/mL 的黄曲霉毒素 B2和G2的系列标准溶液。 液相色谱条件 色谱柱： Poroshell 120 EC C18，4.6x150 mm， 4 um 流速： 1mL/min 柱温： 40°C 流动相： A)水 B)甲醇：乙腈=50：50 (v/v) 等度洗脱： 流动相 A：B=68：32 进样量： 50 uL 荧光检测器设置：激发波长：360nm 发射波长：440nmPMT增益：18 采样频率：4.63Hz 柱后衍生装置： 色谱柱出口管线连接至衍生装置入口，衍生装置出口管线连接至荧光检测器入口，并保持衍生装置电源开启。 4种黄曲霉毒素的色谱分离结果 如图1所示，依照 GB 5009.22-2016 方法对标准曲线第4点浓度的混合标准品中的四种黄曲霉毒素进行分析。结果显示，四种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2得到良好的分离，分离度(Rs)均大于2，且空白进样中未发现对测定产生影响的干扰物质，表明该方法可用于对这四种黄曲霉毒素进行定量分析。 图1.4种黄曲霉毒素的液相色谱-柱后光化学衍生-荧光检测方法分离结果 标准曲线与相关系数 将7个浓度的系列标准溶液按浓度由低到高进样，每个浓度平行进样2次，以峰面积平均值为纵坐标、浓度为横坐标作图，进行线性回归分析。7个浓度点的叠加色谱图以及标准曲线回归分析结果如图2所示。从图中可以看出，黄曲霉毒素B1和G1 在 0.1-40.0 ng/mL 的浓度范围内且B2 和 G2在0.03-12ng/mL 的浓度范围内表现出良好的线性，相关系数R²均高于 0.999。 图2.上图：7个浓度点叠加色谱图；下图：4种黄曲霉毒素的线性回归方程和相关系数 将标准曲线第4点浓度(B1和 G1：5.0ng/mL， B2 和G2：1.5ng/mL)对照品溶液分别进样8次，以考察保留时间和峰面积重现性。结果列于表1中。各分析物的保留时间相对标准偏差 (RSD)均小于0.15%， 且峰面积相对标准偏差均小于0.65%，表明该分析方法具有良好的重现性。 表1.4种黄曲霉毒素的保留时间及峰面积重现性 G2 G1 B2 B1 保留时间 RSD (%) 0.14 0.05 0.06 0.05 峰面积RSD(%) 0.36 0.24 0.65 0.56 方法检测限 对国标 GB 5009.22-2016中规定的最低浓度的标准曲线溶液进行分析，并根据S/N=3计算检测限(LOD)，根据S/N=10计算定量限(LOQ)。最低浓度点标准溶液的色谱图见图3，且LOD 和LOQ结果如表2所示。4种黄曲霉毒素的检测限和定量限完全满足国标中规定的液相色谱-柱后光化学衍生法的要求 (B1， G1要求定量限0.1ug/kg， B2， G2要求定量限0.03ug/Kg)。 此外，为确保低浓度样品检测的稳定性，还对标准曲线最低浓度点进行了重现性考察。将最低浓度的标准曲线溶液进样分析8次，计算峰面积的RSD。结果表明，四种黄曲霉毒素的峰面积 RSD 均小于RSD 均小于6.15%(见表3)，完全可以保证在LOQ附近的检测重现性。 表2.4种黄曲霉毒素的检测限及定量限 G2 G1 B2 B1 LOQ (ppb) 0.02 0.1 0.01 0.05 LOD (ppb) 0.006 0.03 0.003 0.015 表3.4种黄曲霉毒素在标准曲线最低浓度点的峰面积 RSD 值(8次进样) G2 G1 B2 B1 峰面积 RSD(%) 5.06 5.57 3.38 6.15 样品分析结果 采用上述方法对实际大米样品进行分析。大米样品依据国标中的前处理方法进行处理后进样，所得结果见图3。从图中可以看出，黄曲霉毒素的分析不受样品基质的干扰。阳性检出样品中的黄曲霉毒素可以得到灵敏地检测和定量，计算出其中B1和B2的含量分别为 0.396 ppb 和0.039 ppb。 图3.上图：阴性检出大米样品(红色：标样；蓝色：样品) 下图：阳性检出大米样品(红色：标样；蓝色：样品) 方法调整和优化 虽然光化学衍生能够使 G1 及B1的分析灵敏度得到显著提升(峰高增加15倍以上)，但是 G1的分析灵敏度仍然低于其他三种化合物。因此在国标方法的基础上，我们进一步对方法进行了调整和优化：去除流动相中的乙腈，将方法流动相调整为水：甲醇=65：35。分别在流动相中包含乙腈和不含乙腈的条件下(其他色谱条件不变)进样分析相同浓度的样品，所得结果如图4所示。从图中可以看出，各个峰的保留时间基本不变，而不含乙腈的条件使黄曲霉毒素 G1 和B1的峰高分别增加了25%和17%，表明对这两种黄曲霉毒素的灵敏度得到改善。另外，调整流动相后，G1和B2的分离度提高一倍，可以达到6以上。但是去除乙腈后，方法的选择性发生改变，因此在检测不同基质时，可能需要根据样品实际情况调整甲醇的比例以确保干扰物获得完全分离。 图4.上图：国标原始分析方法(流动相含乙腈) 下图：调整后的分析方法(流动相不含乙腈) 本应用简报介绍了一种使用简单的柱后光化学衍生装置和荧光检测器同时测定谷物中黄曲霉毒素B1、B2、G1和 G2的方法。该方法具有良好的线性和重现性，且检测限和定量限完全满足现行国标方法的要求。对实际样品的检测结果表明，该方法能够很好地分离目标分析物与基质峰。与国标中所规定的其他衍生方法相比，本研究所用的光化学衍生方法所需的设备简单、成本低，并且可以避免使用电化学衍生法中对仪器有严重损害的流动相添加剂，或碘/溴衍生中难以配制保存的衍生试剂；与柱前衍生方法相比，可以避免手动衍生操作，并极大地提升操作安全性。该方法中使用 Agilent Poroshell 系列表面多孔色谱柱。这类色谱柱的柱效高、反压低，且具有优异的抗污染堵i塞能力，尤其适合用于复杂食品样品的高通量分析。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 5994-3040ZHCN ( 1. GB 5009.22-2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素 B 族和G族的测定 ) ( 2. Sydenham，E.W.，& Shephard， G.S. (1996) in Progress inFood Contaminant Analysis， J. Gilber t (Ed.)， Chapman andHall，London，UK， pp 65-146 ) 本应用介绍了一种使用简单的柱后光化学衍生装置和荧光检测器同时测定谷物中黄曲霉毒素 B1、B2、G1 和 G2 的方法。该方法具有良好的线性和重现性，且检测限和定量限完全满足现行国标方法的要求。对实际样品的检测结果表明，该方法能够很好地分离目标分析物与基质峰。与国标中所规定的其他衍生方法相比，本研究所用的光化学衍生方法所需的设备简单、成本低，并且可以避免使用电化学衍生法中对仪器有严重损害的流动相添加剂，或碘/溴衍生中难以配制保存的衍生试剂；与柱前衍生方法相比，可以避免手动衍生操作，并极大地提升操作安全性。该方法中使用 Agilent Poroshell 系列表面多孔色谱柱。这类色谱柱的柱效高、反压低，且具有优异的抗污染堵塞能力，尤其适合用于复杂食品样品的高通量分析。