注射用硫酸头孢匹罗中无菌检查检测方案(集菌仪)

中国药事2008年第22卷第1期72 注射用硫酸头孢匹罗无菌检查方法学验证 钱生稳，戴红娟，李 丹((扬子江药业集团，泰州 225321) 摘要： 建立注射用硫酸头孢匹罗的无菌检查方法。本试验参照《中国药典》2005年版二部无菌检查法进行试验。结果表明注射用硫酒头孢匹罗具有抑菌作用。采用验证过的试验方法进行注射用用酸头孢匹罗的无菌检查可行。 关键词： 注射用硫酸头孢匹罗；无菌；抑菌作用；验证 中图分类号：R927.33 文献标识码：A 文章编号：1002-7777(2008)01-0072-03 Study on Test for Sterility of Cef pirome Sulfate for Injection Qian Shengwen， Dai Hongjuan and Li Dan (Yangtze River Pharmaceutical Group， Taizhou 225321) ABSTRACTTTo establish a method for sterility of Cefpirome Sulfate for Injection. The test method wascarried out according to the method in volume two， Chinese Pharmacopoeia Edition 2005. CefpiromeSulfate for Injection has bacteriostatic action. The validated method can be used to test for sterility ofCefpirome Sulfate for Injection. KEY WORDS Cefpirome Sulfate for Injection； sterility； bacteriostatic action； validation 硫酸头孢匹罗 (cefpirome sulfate)属第四代广谱头孢菌素抗生素，由法国Rousel公司和德国Hoechest公司(现改名为 “安万特公司”)共同开发研制。具有广谱抗菌活性，对葡萄球菌、耐青霉素的肺炎球菌及肠球菌均有效，对绿脓杆菌的效果与头孢他啶相似，对很多耐抗生素的病原菌均有良好疗效2。本品剂型属注射剂类，为了确保临床用药安全，《中国药典》2005年版规定需进行无菌检查。本试验旨在按 《中国药典》2005所载 “无菌检查法”，验证并建立注射用硫酸头孢匹罗(规格：0.25g)的无菌检查方法。 1 环境与仪器材料 1.1 试验环境 见表1. 1.2 仪器与试药 HTY-2000A型智能集菌仪(转速设为160r·min )、KD GB330 一次性全封闭集菌培养器、HTYK型培养器专用振荡仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)、LRH-250生化培养箱(上海索普仪器有限公司)；注射用硫酸头孢匹罗(扬子江药业集团有限公司，规格：0.25g，批号：07012001)；β内酰胺酶(北京科技协作中心，中国药 表1 试验环境监测结果 监控项目 无菌室 无菌室 阳性 阳性检查室 净化工作台 检查室 净化工作台 洁净级别 10000 100 100000 100 尘埃粒子数 ≥0.5um 4466 0 904 0 ≥5um 0 0 551 0 沉降菌 0 0 0 浮游菌 0 2 0 温度(℃) 相对湿度(%) 品生物制品检定所分部，批号：20051152，装量：2mL，含量>300万单位)。 1.3 试验用菌株 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) [ CMCC(B) 26003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugino sa)[CMCC (B)10104]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63501]、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[ CMCC (B)64941]、白色念珠菌(Candida albicans) [ CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003](中国药品生物制品检定所)。 ( 作者简介：钱生稳，大学本科，助理工程师； Tel：(0523) 86978859； E- mail ： money1980 @126. com ) 1.4 培养基、冲洗剂及稀释剂(培养基的适用性检查参照《中国药典》2005年版) 1.4.1 干粉：硫乙醇酸盐培养基(批号：0603302)、改良马丁培养基(批号：060421)、营养肉汤培养基(批号：060322)、改良马丁琼脂培养基 (批号：060421)、营养琼脂培养基.((批号：060518)、玫瑰红钠琼脂培养基基(批号：060220) (北京三药科技开发公司)。 1.4.2 0.9%灭菌氯化钠溶液、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液(扬子江药业集团有限公司输液车间配制)。 2 方法与结果[3-4] 2.1 菌液制备 分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~355C培养18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23~28 ℃培养24~48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数小于100 cfu 的菌悬液；接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数小于100 cfu 的孢子悬液。见表2. 试验菌名称 稀释级 菌落形成数 接种量 规定接种量 (cfu·mL") (mL) (mL) 金黄色葡萄球菌 10~6 小于 100cfu 铜绿假单胞菌 10~6 小于100cfu 枯草芽孢杆菌 10~5 小于 100cfu 生孢梭菌 10~5 72 小于 100cfu 白色念珠菌 10~5 71 小于 100cfu 黑曲霉 10~6 70 小于100cfu 2.2.1 操作方法 安装好集菌培养器，过滤前先用0.9%无菌氯化钠溶液50mL 润湿滤膜，以发挥滤膜的最大过滤效率。分别向每个培养器内抽入50mL 0.9%无菌氯化钠溶液。将每30瓶样品抽入3支分别含有0.9%无菌氯化钠溶液50mL的培养器内，同时振摇滤筒使过滤。每张滤膜过滤的样品量为10瓶。最后用各试验条件下的冲洗量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(以下简称“缓冲液”)振荡冲洗，前4次每次50mL，后每次100mL，并在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤。分别在细菌培养器中加入硫乙醇酸盐流体培养基100mL，在真菌培养器中加入改良马丁培养基100mL，再分别加入适量中和剂。按规定温度将上述集菌器培养3~5d。 2.2.2 预试验组 选择枯草芽孢杆菌为预试验组的敏感菌株，取60瓶供试品按操作步骤进行操作，每管冲洗量、加入的中和剂量、试验结果见表3。 冲洗量+ 试验组(供试品+试验菌+中和剂+培养基) 中和剂+培养基) 对照组(试验菌 400mL 500mL 600mL 600mL 700mL 800mL 0mL 0mL +培养基) β内酰胺酶量 +1ml +1mL +1ml ±2mL ±1ml +1mI 土1mL +2mIL 结果 . --+ 注：冲洗量指每管滤筒加入的缓冲液量；β内酰胺酶量是指每管滤筒加入的中和剂量。 “+”代表有菌生长，“-”代表无菌生长；“. "代表5天观察都无菌生长、“-+”表示第2天观察到有菌生长。 2.2.3 平行试验组 一次试验取60瓶供试品按 2.2.1操作方法进行操作，每管管洗600mL 缓冲液，取相同批号样品进行两次独立平行试验，并在每管最后一次冲洗液中加入小于100cfu 金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉、白色念珠菌，再向集菌器中加入相应的培养基100 mL、2mLβ内酰胺酶。结果见表4. 2.2.4 样品的无菌检查 取样品30瓶按2.2.1操作方法进行操作，每管冲洗600mL缓冲液(前4次每次50mL，后4次每次100mL)，最后向一支泵入硫乙醇酸盐流体培养基的滤管中加入小于100cfu 表4 平行试验结果 样品批号 金黄色葡 铜绿假 枯草芽 生孢 白色 黑曲 萄球菌 单胞菌 孢杆菌 梭菌 念珠菌 霉 07012001 + + 十 + 07012001 + + + 的大肠埃希菌，3支管分别按规定温度培养14d，每日观察，供试品管均澄清，阳性管生长良好，判供试品符合规定。 3 讨论 由上表3，当每管滤筒分别用((下转第76页) 表3 用培养基稀释法来再验证大肠埃希菌 菌液组 200605271 200604111 200509081 CFU 试验组CFU 平均CFU 回收率(%) 试验组CFU 平均CFUJ 回收率(%) 试验组CFU 平均CFU 回收率(%) 74 65，72，81，64 72，77，91 ，63 57，64，78，50 74 67.54.86.62 69 93 47.72.53.71 68 92 68.63.71.41 62 84 表4 金黄色葡萄球菌检查方法验证结果 培养基 供试品组 20mL 试验组 阴性对照组 20mL+金葡菌 20mL+大肠杆菌 (37个) (62个) 营养肉汤培养 基(100mL) 甘露醇氯化钠 琼脂 表5 铜绿假单胞菌检查方法验证结果 培养基 胆盐乳糖增菌 供试品组 20mL 试验组 阴性对照组 20mL+铜绿假 20mL+大肠 单胞菌(75个) 杆菌(62个) + + 液(100mL) 溴化十六烷基 + 三甲胺琼脂 注：上表中“-”表示无菌生长：“+”表示有菌生长 从上述结果可看出，试验组检出试验菌，阴性菌对照组未检出阴性菌，说明薄性康药膜在此检验条件下无抑菌作用，常规法可用于该供试品的控制菌检查。 4 结论 通过对本品进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，可以确认采用平皿法适用于博性康药膜的 (上接第73页) 400、500、600、700mL 缓冲液冲洗并加1mLβ内酰胺酶进行操作时，试验菌在规定时间是不生长的；而当用每管冲600mL缓冲液加2mLβ内酰胺酶和每管冲800mL 缓冲液加1mLβ内酰胺酶的方法进行操作时：试验组与对照组比较试验菌生长是良好；中和剂对照组与对照组比较试验菌生长也是良好的。由此可知加入的中和剂对试验菌的生长无不良影响，600mL 缓冲液加2mLβ内酰胺酶和800mL 缓冲液加1mLβ内酰胺酶的冲洗条件都是可行的，但考虑到加大冲洗量对滤膜可能产生不良影响，最终选定用每管冲600mL 缓冲液加2mL B内酰胺酶的方法对6种试验菌进行两次平行试验。 霉菌及酵母菌的测定；采用培养基稀释法适用于博性康药膜的细菌测定。 通过对本品控制菌检查方法的验证认为：博性康药膜的金黄色葡萄球菌检查和铜绿假单胞菌检查可使用常规检查法 通过验证发现：博性康药膜处方中的成分虽然具有一定的抑菌或杀菌作用，但通过1：20的稀释后，对大部分细菌和霉菌的抑制作用不大，再经过培养基稀释后，基本上可以消除它的抑制作用。所以博性康药膜的微生物限度检查方法为：细菌测定采用培养基稀释法；霉菌及酵母菌的测定采用平皿法；金黄色葡萄球菌检查和铜绿假单胞菌检查可使用常规检查法。 ( 参考文献： ) ( [1] 苏德模，马绪荣.药品微生物学检验技术[M].北京：华 齿出版社，2007：209. ) ( [2] 中国药典[S].一部，2005：附录70. ) ( [3] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范 [M].北京：中国医药科技出版社，2005：325. ) ( [4] 许华玉，杜芸，钱文静，等.药品微生物检查中细菌和真菌计数方法的验证试验[J].中国中药杂志，2005，(24)：1918. ) ( [5] 许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必 要性[J].中国药品标准，2005，(4 ) ：46. ) ( [6] 向东.影响微生物限度检查及方法验证的因素分析[J].现 代医药卫生，2007，(15)：2329. ) 通过表4可以看出，每管冲600mL 缓冲液加2mLβ内酰胺酶的方法满足验证的要求，故可以在此条件下进行注射用硫酸头孢匹罗(规格：0.25g)的无菌检查。 ( 参考文献： ) ( [1] 蔡伟，乔阳，李薇.注射用硫酸头孢匹罗细菌内毒素检查的 方法学研究[J].中国药业，2006，15(7)：36. ) ( [21 李霞，刘映倩，刘元书，等.硫酸头孢匹罗对其细菌内毒素检查 的影响因素分析[J].药物分析杂志，2006，26(7)：971. ) ( 中国药典 [S].二部，2005：附录6. ) ( 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范 [M].北京：中国医药科技出版社，2005：313. ) ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net