太平洋牡蛎（山东乳山生蚝）中蛋白质和脂肪含量的检测

冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期氧化应激及能量消耗的影响广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 42卷 第 2期2022年 3月Vol.42 No.2Mar. 2022 广东海洋大学学报第 42卷96 林恒宗，高加龙，梁志源，等 .冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期氧化应激及能量消耗的影响 [J].广东海洋大学学报，2022，42（2）：95-103. 冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期氧化应激 及能量消耗的影响 林恒宗 1,2，高加龙 1,2，梁志源 1，范秀萍 1,2，林海生 1,2，曹文红 1,2，黄艳平 1，秦小明 1,2 （1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524025；2.国家贝类加工技术研发分中心（湛江）//广东省水产品加工与安全重点实 验室 //广东省海洋食品工程技术研发中心 //广东省海洋生物制品工程重点实验室 //水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东 湛江 524088） 摘 要 ：【目的】系统分析太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas)保活运输前的预冷方式及温度胁迫对其氧化免疫系统、能量物质代谢的影响，筛选出较好的无水保活前预冷方式。【方法】分别采用散冰自然降温、急性连续降温、线 性匀速降温、梯度降温 4种低温诱导休眠方式处理牡蛎，并探讨不同诱导休眠方式对牡蛎生态冰温无水保活期的 存活率、失重率、抗氧化能力以及能量物质代谢的影响。【结果】1）梯度和线性降温牡蛎冰温保活 9 d 其存活率 及失重率优于散冰和急性降温组。2）各组牡蛎在整个保活期内抗氧化酶活力均升高，且散冰降温组显著高于急 性、线性和梯度降温组 (P < 0.05)；散冰和急性降温组丙二醛 (MDA)含量呈明显上升趋势，而线性和梯度降温 组先降后升高；各不同降温组过氧化氢 (H2O2)含量则先升后降；总抗氧化能力 (T-AOC)随胁迫时间延长呈上 升趋势。3）散冰降温组在整个保活期内能量物质均显著低于各组 (P < 0.05)，保活 9 d 后线性和梯度降温组水分、糖原、脂肪含量高于各组，乳酸含量则低于各组。【结论】采用线性和梯度降温方式诱导牡蛎进入生态冰温休眠 状态后开始无水保活，有利于减缓牡蛎在冷胁迫下抗氧化酶活力及脂质过氧化的影响，且保活时间更长，失重率 更低，能量代谢物质损失较少，更有利于牡蛎长时间无水保活。 关键词 ：太平洋牡蛎；休眠方式；生态冰温；无水保活；氧化应激；能量代谢 中图分类号 ：Q939.11 文献标志码 ：A 文章编号 ：1673-9159（2022）02-0095-09 doi ：10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.012 Effect of Cold Stress Methods on Antioxidant and Energy Metabolism of Crassostrea gigas in Water-free Live Storage Period LIN Heng-zong1,2, GAO Jia-long1,2, LIANG Zhi-yuan1, FAN Xiu-ping1,2, LIN Hai-sheng1,2, CAO Wen-hong1,2, HUANG Yan-ping1, QIN Xiao-ming1,2 （1. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China;2. National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing (Zhanjiang) //Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety // Guangdong Province Engineering Laboratory for Marine Biological Products // Guangdong Provincial Engineering 收稿日期：2021-12-02 基金项目：“十三五”国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项（2019YFD0901601） 第一作者：林恒宗（1996―），男，硕士研究生，研究方向为贝类净化及保活运输技术。E-mail ：1074680995@qq.com 通信作者：秦小明（1964―），男，教授，研究方向为贝类净化和水产品保活运输技术。E-mail ： xiaoming0502@21cn.scom Technology Research Center of Marine Food // Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution, Zhanjiang 524088, China ） Abstract: 【Objective 】 To systematically analyze the effects of pre-cooling and temperature stress on the oxidative immune system and energy metabolism of Crassostrea gigas before live transport, and select a better pre-cooling methods before waterless keep alive. 【Method 】Oysters were either treated by natural cooling, acute continuous cooling, linear uniform cooling and gradient cooling in crush ice. T T h h e e s s u u r r v v i i v v a a l l r r a a t t e e ,, w w e e i i g g h h t t l l o o s s s s r r a a t t e e ,, a a n n t t i i o o x x i i d d a a n n t t c c a a p p a a c c i i t t y y ,, e e n n e e r r g g y y m m e e t t a a b b o o l l i i s s m m o o f f t t h h e e o o y y s s t t e e r r w w e e r r e e determined to evaluate the best method of dormancy induction. 【Results 】 1) the survival rate and weight loss rate of gradient and linear cooling methods were better than the natural cooling and acute cooling. 2) The antioxidant enzyme activity of each group increased during the whole live storage, ice cooling group was significantly higher than acute, linear and gradient cooling groups (P < 0.05); MDA content in natural cooling and acute cooling group were increased significantly. In contrast, the MDA value showed an initial decreased then increased trend in the linear and gradient cooling groups; each groups. The H2O2 level of all test groups showed an initial increased and then decreased pattern while the T-AOC was at an upward trend when the stress time was extended. 3) The energy content of ice cooling group was significantly lower than other groups during the test period (P < 0.05). The moisture, glycogen and fat content of the linear and gradient cooling groups were higher than the others groups, but lactic acid was lower than them. 【Conclusion 】When the C. gigas under ice are induced dormancy and are kept waterless after treatment by linear and gradient cooling methods (cooling rate ≤ 5 ℃/h), the antioxidant enzyme activity and lipid peroxidation will be reduced. The survival time is extended, the weight loss rate and the loss of energy metabolites is lower for the cold stress group, which is more conductive to the waterless keep alive retention of oysters. Key words: Crassostrea gigas; hibernation methods; ecological ice temperature; waterless keep alive; oxidative stress; energy metabolism 太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas)是我国产量最 高的牡蛎品种，主要分布在辽宁、山东等长江以北 地区。牡蛎不仅味道鲜美且富含蛋白质、糖原、氨 基酸、微量元素及维生素等营养物质 [1-2]，深受消费 者青睐。牡蛎在我国主要以鲜销为主，但当前产业 中牡蛎无水保活流通作业时缺乏系统的降温预冷 工艺技术，鲜活牡蛎采捕后大多采用泡沫箱加冰强 迫其进入休眠状态，后进入保活流通工序。然而，大幅降温会导致机体产生大量活性氧 (Reactive Oxygen Species ，ROS)，ROS 会对细胞造成损伤、组织正常的生理机能和免疫防御能力产生不可逆 的损害，从而影响其存活质量 [3]。在虾夷扇贝 (Patinopectenyessoensis)[4]、皱纹盘鲍 (Haliotis discus HannaiIno)[5] 、溢蛏 (Sinonovacula constricta)[6]、岩扇贝 (Crassadoma gigantea) [7]、魁 蚶 (Scapharcabroughtonii)[8]等贝类的研究中都已 证实温度急剧变化对抗氧化系统及生理代谢产生 直接影响。因此，合理的降温方式对延长贝类保活 时间和保持贝类鲜度品质非常重要。目前关于太平 洋牡蛎保活运输前的预冷方式及温度胁迫对其氧 化免疫系统、能量物质代谢的研究鲜有报道。因此，本研究模拟当前国内太平洋牡蛎流通模式，将新鲜 捕捞的牡蛎运抵实验室后暂养净化，采用不同降温 方式对净化后的牡蛎进行诱导休眠处理，探索降温 方式对牡蛎生态冰温保活过程中氧化应激及能量 物质的影响，以期为双壳贝类保活前处理工序、低 温保活运输条件优化提供技术和理论参考。 1 材料与方法 乳山生蚝 1.1 材料 鲜活太平洋牡蛎 (C. gigas ），2021年 3月购自 山东威海灯塔水母海洋科技有限公司，采捕后挑选 富有活力、双壳完整、规格相近的带泥个体作为研 究对象，迅速分装于套有内膜保湿袋的泡沫箱中，装箱前及装箱完成后在其表面与底面平铺一层约 3~ 5 cm 海水冰，且用吸水海绵与贝体隔开，经专用 牡蛎冷链运输车运输 48h 后运抵广东海洋大学水 产品保活流通实验室暂养净化，以消除捕捞和运输 操作时应激反应。牡蛎的平均生物学指标见表 1。 表 1 太平洋牡蛎生物学指标 Table 1 Biological index of Crassostrea gigas used (mean ±SD) 壳长 Shell length / mm 壳宽 壳高 Shell height / mm 湿质量 Wet body weight / g 外壳质量 软组织质量 Shell width / mm Weight of shell / g Weight of soft tissue / g 106.26±4.92 52.93±5.80 36.12±4.27 103.46±5.02 92.92±1.25 10.26±1.08 1.2 主要仪器设备与试剂 贝类暂养净化系统，广州创岭水产有限公司； GXG-1低温恒温层析柜，江苏盛蓝仪器有限公司； JK-8多点温度计，常州金艾联公司；Varioskan Flash 全自动酶标仪，美国 Thermo 公司；VAP450全自动 凯氏定氮仪，德国 Gerhardt 公司； 粗脂肪 测定 ；HX204卤素 水分测定仪，瑞士梅特勒公司。 超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、过氧化物酶 (POD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)、丙二醛 (MDA)、过氧化氢 (H2O2)、总 抗氧化能力 (T-AOC)、糖原 (Gn)、乳酸 (LD)、蛋 白质含量检测试剂盒均购自南京建成生物工程研 究所。其余化学试剂为分析纯。 1.3 设计与方法 1.3.1 人工海水配制 在贝类净化系统中按太平 洋牡蛎养殖海域盐度 (31±0.5) [9]，用海水晶配制人 工海水，开启增氧设备持续曝气 24 h ，通臭氧至海 水臭氧质量浓度为 0.15 mg/L ，以流速 2.5 m3/h 通过 紫外灯管进行灭菌，设定水温 25 ℃循环预冷备用。 1.3.2 牡蛎暂养净化 采用灭菌人工海水清洗牡 蛎表面附着物，将清洗后的牡蛎放入塑料筐 (600mm ×420mm ×315 mm)置于贝类净化系统 中，参照慕翠敏等 [10]和费星等 [11]的人净化工艺条件 进行净化：水温 25 ℃，贝水质量（kg ）体积（L ）比 1：20，臭氧质量浓度 0.15 mg/L ，于盐度 31的 紫外循环灭菌人工海水中净化 24 h ，塑料筐与槽底 距离 2.5 cm 以上防止二次污染。 1.3.3 牡蛎生态冰温的确定 临界温度测定参照 储建军等 [12]方法。挑选净化后富有活力的牡蛎 20只放入装有人工海水的透明玻璃容器内 (320mm ×150 mm ×212 mm)内，通过调节低温恒温设 备及加入人工海水冰块进行缓慢降温，同时观察箱 内牡蛎的存活状态和对外界刺激的反应情况。牡蛎 双壳自然张开，剌激反应微弱甚至无反应作为临界 温度点。 结冰点测定参照徐德峰等 [13]实验方法。挑选净 化后富有活力的牡蛎 10只，将多点温度计温度探 针插入牡蛎肌肉内部，置于 -20 ℃低温冰箱中，每 5 s 记录肌肉内部的温度，直到个体完全冻结。以时 间为横坐标，温度为纵坐标绘制冻结曲线，根据冻 结曲线拐点确定结冰点。由上述临界温度和冻结点 测定结果及生态冰温定义确定太平洋牡蛎生态冰 温范围。 1.3.4 牡蛎诱导休眠方法 将净化后挑选的 600只 太平洋牡蛎随机分为 4组，每组 150只，参照郝爽 等 [7]降温方法并加以改进，分别采用 4种降温诱导 休眠方式。其中散冰降温处理方式为：将牡蛎分装 于泡沫箱中（450 mm ×250 mm ×200 mm ），约 5 kg/箱，装箱前后在其四周及表层平铺淡水冰，加 盖后放置在 0 ℃的恒温层析柜中开始无水保活。另 外三种降温方式则是将牡蛎分装于保活塑料筐中，塑料筐的四周及表面均覆盖一层浸足灭菌海水的 海绵，为保证环境湿度，每 12 h 向海绵喷淋灭菌海 水。急性降温的处理方式为直接将牡蛎置于 0 ℃的 层析柜中，开始无水保活；线性及梯度降温速率参 照胡益鸣等 [14]的实验结果，通过调节恒温层析柜，以 5℃/h 的降温速率从（25±0.5）℃降至（0±0.5）℃后开始无水保活，其中梯度降温组牡蛎温度 每下降 5 ℃停留 90 min 。各实验组牡蛎在诱导休眠 结束后开始无水保活工序，保活周期为 9 d ，分别 在降温前（BC ）、降温后（AC ）及保活期每天监测 牡蛎存活及失重情况，另取腮和肌肉组织检测相关 生化指标。 1.4 样品采集、制备与指标测定 1.4.1 存活及失重率监测 检活方法参照高加龙 等 [15]实验方法，每 24 h 观测牡蛎的贝壳张开情况， 能自由闭合为活贝，不能闭合为死贝，依据存活及 死亡数量绘制存活曲线。失重率监测参照申淑琦 等 [16]实验方法，选取个体差异较小、规格相近、富 有活力的牡蛎 20只，每天记录总质量。失重率为 保活前后牡蛎质量损失与初始质量之比。 1.4.2 抗氧化酶活力测定 每组随机取 9只牡蛎，迅速开壳取鳃，用预冷质量分数为 0.86%生理盐水 漂洗，吸水纸拭干表面水分，按质量（g ）体积 (mL)比 1：9的比例加入预冷生理盐水进行冰浴机械匀 浆，将制备好的体积分数为 10%的匀浆液在 4 ℃下 以 12 000 r/min 的转速离心 10 min ，取上清于洁净 EP 管中，立即测定或-80℃冻存待测。严格按照 试剂盒操作规程检测腮组织中蛋白质含量、SOD 、CAT 、POD 、GSH-PX 、MDA 、H2O2、T-AOC 酶活 力，结果以蛋白浓度计算。 1.4.3 能量代谢指标测定 每组随机取 15只牡蛎，迅速开壳刨取牡蛎全脏器，用预冷的质量分数为 0.86%生理盐水漂洗，吸水纸拭干表面水分，采用 高速匀浆机搅碎成肉糜状，分装，立即测定或 -80 ℃冻存待测。严格按照试剂盒操作规程检测肌 肉组织中 Gn 、LD 含量。水分、粗蛋白、粗脂肪含 量分别按照国标 GB 5009.3-2016、GB 5009.5-2016、GB 5009.6-2016测定。 1.5 数据分析 实验结果均平行测定三次，数据采用平均值±标准偏差表示，对非正态分布数据存活率采用平方 根反正弦变换后进行统计分析，对试验结果采用统 计分析软件 SPSS 26.0进行单因素方差分析 (One-WayANOVA)及组间差异采用 Duncan 多重 比较，显著性水平 α 设为 0.05。 2 结果与分析 2.1 太平洋牡蛎生态冰温零点测定 太平洋牡蛎在缓慢降温过程中的行为特征如 表 2所示。在 5 ℃以上太平洋牡蛎生理活动正常；当温度降至 5 ℃时，应对外界刺激反应缓慢；3 ℃时基本无滤水表征现象，置于室温条件下能缓慢闭 壳，表明太平洋牡蛎此时处于半休眠状态；0 ℃时 对外界刺激已无任何反应，但置于常温人工海水能 恢复正常滤水现象；-1 ℃时对外界刺激无反应，壳边缘出现微冻现象，温度继续降低成活率下降。判定牡蛎生态冰温零点约为 0 ℃。 表 2 不同温度下太平洋牡蛎活动状态 Table 2 Status of Crassostrea gigas at different environmental temperatures 温度 存活率 目测现象 Temperature/ Survival Visual phenomenon ℃ rate / % 15 100 双壳张开自然；滤水现象明显，并伴随 杂质吐出。 10 100 双壳张开自然；触碰即有气泡产生，并 略微闭合，反应强烈。 部分双壳张开，部分闭合；用玻璃棒触 5 100 碰反应缓慢，部分无反应。 大部分敲击反应缓慢，但离水后室温条 3 100 件下能恢复正常闭壳。 用玻璃棒敲击基本无反应，在室温条件 1 100 下仍能缓慢闭合。 敲击无反应，放入常温水中约 3 h壳能 0 100 恢复正常张闭。 离水后置于室温条件下无反应，部分开 壳后发现肌肉及贝壳边缘出现微冻现 -1 90 象，未开壳牡蛎置于常温海水中暂养 3 h部分能恢复正常张闭壳，部分死亡。 2.2 太平洋牡蛎结冰点测定 只有确定太平洋牡蛎耐受低温极限温度，才能 通过控制适当低温使牡蛎处于休眠状态且不至于 温度过低导致死亡。由图 1可见，当温度降至 -1.7 ℃时，牡蛎体内释放出大量潜热，此阶段牡蛎 肌肉降温速度缓慢，甚至温度维持不变，因此得出 太平洋牡蛎结冰点为 -1.7 ℃，温度继续下降将导致 肌肉结冰而引起牡蛎死亡。结合牡蛎生态冰温零 点，太平洋牡蛎在无水保活过程中温度范围控制在 -1.7 ~ 0℃。根据研究结果，机体越接近冰点温度 易造成冷胁迫损伤，因此，在生态冰温保活过程中 温度应尽量远离冰点温度。 2.3 冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期生命体 征的影响 2.3.1 存活分析 不同降温方式对太平洋牡蛎无 水保活过程存活曲线变化如图 2所示。在冷胁迫下 太平洋牡蛎存活率随保活时间延长均呈明显右移 趋势。散冰自然降温组在保活 1 d 开始出现死贝，急性连续降温组在保活 2 d 开始出现死贝，梯度和 线性匀速降温组在保活 3 d 出现死贝；对比 4种不 同降温方式，梯度降温组存活率最高，散冰自然降 温组最低，保活 6 d 全部死亡；梯度、线性、急性 降温组保活 9 d 后存活率分别为 90%、85%、79%。可见，降温预冷方式对双壳贝类无水保活过程中存 活率有较大影响。同时说明胁迫强度越大会加速太 平洋牡蛎生理代谢 ,降低机体对环境的适应能力，引起死亡，并随着时间延长而加剧，本实验保活条 件下太平洋牡蛎的存活率与香港牡蛎 (Crassostrea hongkongensis)保活结果接近 (保活 9d ，存活率 95%)[15]。 方框指示太平洋牡蛎冻结温度点 The box indicates freezing temperature of Crassostrea gigas 图 1 太平洋牡蛎冻结曲线 Fig. 1 The freezing curve of Crassostrea gigas 图 2 不同冷胁迫方式下太平洋牡蛎无水保活期存活变化 Fig. 2 Survival curves of Crassostrea gigas during waterless keep alive under different cold stress methods 2.3.2 失重率 不同降温方式对太平洋牡蛎无水 保活期失重率的影响如图 3所示，随着保活时间延 长所有不同降温处理组牡蛎失重率均呈明显上升 趋势，且不同降温方式对质量失重率的影响有一定 差异。对比 4种不同降温方式，散冰自然降温组在 整个保活期内质量损失率明显低于其他 3组，主要 是由散冰融化，牡蛎长时间浸泡在冰水中所致。从 保活 2 d 开始，梯度和线性降温组失重率明显低于 急性连续降温组；保活 5 d 时失重率分别为 11.98%和 11.39%，而急性降温组保活 5 d 时高达 15.78%；保活 9 d 后急性、线性和梯度降温组失重率分别为 20.46%、16.82%、14.18%。结合存活率分析，可见 采用线性和梯度的降温方式对牡蛎无水保活过程 质量损失影响最小。 保活时间 Keep-alive time / d 图 3 不同冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期失重率的 影响 Fig. 3 Effects of different cold stress methods on the weight loss rate of Crassostrea gigas during the waterless keep alive 2.4 冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期抗氧化 酶活力的影响 图 4(A-B)可知，在不同降温方式胁迫下，太平 洋牡蛎腮组织中的 SOD 、CAT 活力均随保活时间的 延长呈上升趋势。降温后各组 SOD 、CAT 活力较降 温前明显升高，散冰自然降温组在保活前 3 d 均显 著高于其他降温组 (P < 0.05），在保活终期呈下降 趋势；急性降温组 SOD 、CAT 活力随保活时间延长 呈直线上升趋势，且在保活 7 ~ 9 d CAT 活性显著高 于线性和梯度降温组 (P < 0.05）；但线性和梯度降 温组在保活 0 ~ 3 d ，SOD 、CAT 活力与降温后相比 无明显增加 (P > 0.05)，随后呈缓慢增长趋势，除 保活 3 d 外，线性和梯度降温组 SOD 、CAT 活力在 降温后保活 1 ~ 9 d 无明显差异 (P > 0.05)。表明，散 冰与急性连续降温属于温度突变的降温方式，易导 致牡蛎长时间处于应激状态，机体无法通过自身调 节修复，氧化应激损伤明显高于线性和梯度降温 组。温度作为主要的环境因子，对水生生物生理生 化反应产生直接影响。在常温状态下，ROS 处于动 态平衡，但贝类在无水保活过程中受低温缺氧等因 素胁迫，体内黄嘌呤脱氢酶可转化为黄嘌呤氧化 酶，线粒体电子传递链载体失活，产生大量 ROS ，但贝类自身具备一套完整的抗氧化体系来维持机 体 ROS 平衡 [17-18]。由郝爽等 [6]研究表明急性低温胁 迫下溢蛏组织中 SOD 、CAT 活力随处理时间延长呈 不断升高趋势。陈丽梅等 [19]研究发现，温度突变胁 迫后毛蚶 (Scapharca subcrenata)组织中 SOD 、CAT 活力明显升高。刘玲等 [20]发现，渐变温度胁迫 下对杂交石斑鱼 (Cromileptes altivelis Valenciennes♀ × Epinephelus lanceolatus♂)幼鱼抗 氧化能力影响较小，这些研究结果均提示不良环境 胁迫会诱导机体 SOD 、CAT 活力升高，与本研究结 果一致。 GSH-PX 与 POD 它们在维持自由基平衡和减 少应激损伤方面发挥着重要作用，在应激状态下 GSH-PX 将 H2O2和有机过氧化物转化为 H2O ，而 POD 则具有降解消除 H2O2和酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用 [21]。由图 4(C-D)可知，太平洋 牡蛎腮组织中的 GSH-PX 与 POD 活力均随保活时 间的延长呈上升趋势，除保活 3 d 外，散冰降温组 牡蛎 GSH-PX 活性与急性降温组在降温后、保活 1d 、保活 5 d 无显著差异 (P > 0.05)，散冰自然降温 组和急性降温组在降温后保活 1 ~ 9 d 均显著高于 线性和梯度降温组 (P < 0.05)；线性和梯度降温组 在降温后保活 1 ~ 9 d POD 活力变化不明显 (P >0.05)。可见 GSH-PX 、POD 与 SOD 、CAT 在清除 自由基抵抗氧化损伤过程中发挥着相互协同及补 充的作用，同时也表明在强应激条件下，牡蛎表现 出更强的生理应激响应，线性和梯度渐变降温方式 更有利于维持牡蛎抗氧化系统平衡。这一变化规律 与李晓英等 [22]对温度渐变下青蛤 (Cyclina sinensis)肝胰腺组织中抗氧化酶活力的研究结果相似。 同一时间下，凡含一个相同字母表示组间无显著差异 (P > 0.05) At the same time, the data with a same letter means no significant difference between them （P ＞0.05） 图 4 不同冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期 SOD(A)、CAT(B)、GSH-PX(C)、POD(D)的影响 Fig. 4 Effects of different cold stress methods on the SOD(A), CAT(B), GSH-PX(C), POD(D) of Crassostrea gigas during the waterless keep alive MDA 含量代表脂质过氧化程度，间接反映组 织细胞受自由基攻击的程度。一般来说，MDA 含 量越高，生物体所受的压力越大 [23]。由图 5(A)可见，太平洋牡蛎腮组织中的 MDA 含量均随保活时间的 延长呈上升趋势且在降温后保活 1 ~ 5 d 散冰自然 降温组 MDA 含量明显高于其他降温组 (P < 0.05)，急性和线性降温组在降温后 MDA 含量明显高于梯 度降温组 (P < 0.05)，线性和梯度降温组在保活前 期无明显变化，急性降温组 MDA 质量摩尔浓度在 保活 9 d 达到最高值（13.1 nmol/g ），显著高于线性 和梯度降温组 (P < 0.05)。表明，短期冰温胁迫下 牡蛎抗氧化系统被激活，加速清除过多 MDA 以维 持体内抗氧化系统平衡，但长时间冰温胁迫易导致 牡蛎受到脂质过氧化损伤且强应激条件下牡蛎表 现出更强的生理应激响应，散冰和急性降温组尤为 明显。大量研究表明，机体在应激胁迫条件下 MDA 含量急剧上升，如岩牡蛎 (Crassostreanippona)[14]在急性温度胁迫下腮组织中 MDA 活力显著上升，华贵栉孔扇贝 (Chlamys nobilis)[24]在遭受低温胁迫 下 MDA 含量有所升高，以上结果均与本实验研究 变化趋势相似。 需氧生物在氧化还原反应中产生大量的 ROS ， SOD 将机体内产生的 ROS 分解成 H2O2，而 CAT 、POD 、GSH-PX 又将 H2O2还原成氧分子 (O2)和水 (H2O)，从而消除 ROS 对机体的影响 [4]。由图 5(B)可见，各不同降温组 H2O2含量随保活时间延长总 体呈先上升后下降趋势。在降温后保活 1 ~ 9 d ，散 冰自然降温组 H2O2含量均显著高于各降温组 (P <0.05)；急性降温组 H2O2含量在保活 5、7、9 d 显著 高于线性和梯度降温组 (P < 0.05)；线性和梯度降 温组 H2O2含量在降温后保活 1~9 d 无明显差异 (P > 0.05)。结表明，散冰和急性降温组在受到直接 冰温胁迫后通过 SOD 产生大量 H2O2未被及时消 解，且随着时间延长氧化应激逐渐加深，而线性和 梯度降温组属温度渐变方式，机体 H2O2能被 SOD 、CAT 、POD 、GSH-PX 协同及时有效清除，有效阻 止氧化应激的进一步损伤。本结果与郝爽等 [25]报道 的急性低温胁迫对溢蛏 H2O2的变化趋势相似。 T-AOC 是反映机体抗氧化能力的综合指标，它 可以反映机体抗氧化防御系统应对外来胁迫的能 力 [26]。由图 5(C)可见，散冰降温组在降温后保活 1 ~9 d ，T-AOC 水平显著高于其他 3组 (P < 0.05)，且 在保活终期呈下降趋势；提示在长时强应激胁迫下 由于牡蛎活力不足，致使体内总抗样化能力下降。除保活 1 d 外，急性降温组在降温后保活 3 ~ 9 d 内 T-AOC 含量均高于梯度降温组 (P < 0.05)，线性和 梯度降温组无明显差异 (P > 0.05)，且梯度降温组 在保活期内始终维持在降温前水平。 整体来看，T-AOC 水平的变化情况与 SOD 和 CAT 活力变化呈现高度的一致性，同时也表明，散 冰和急性冰温胁迫导致牡蛎 ROS 快速富集，抗氧化 体系做出应答，表现为各种抗氧化酶活力以及总抗 氧化能力显著升高，但线性和梯度缓慢降温方式在 短时间内能通过自身调节来维持体内抗氧化系统 平衡，长时间冰温胁迫会对机体造成一定的氧化应 激损伤。曹善茂等 [27]研究表明，岩牡蛎在低温胁迫 下对其 T-AOC 能力有明显抑制作用。Gu 等 [28]研究 表明，珍珠贝 (Pteria penguin)在遭受干露胁迫时，总抗氧化能力呈先上升后下降趋势，以上结果均与 本研究变化趋势相似。 （A ） 25 急性降温 线性降温 梯度降温 散冰降温 a 20 -1g a a a 0.0 BC AC 1 3 5 7 9 保活时间 Keep-alive time / d 同一时间下，凡含一个相同字母表示组间无显著差异 (P > 0.05) At the same time, the data with a same letter means no significant difference between them （P ＞0.05） 图 5 不同冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期 MDA(A)、H2O2(B)和 T-AOC(C)的影响 Fig. 5 Effects of different cold stress methods on the MDA(A), H2O2(B) and T-AOC(C) of Crassostrea gigas during the waterless keep alive 2.5 冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水保活期能量代 谢的影响 不同低温诱导休眠方式对太平洋牡蛎主要能 量物质变化见表 3。可以看出，散冰自然降温组牡 蛎受到冰温胁迫后脂肪和肌糖原变化明显 (P<0.05)；急性降温组受到冰温胁迫后肌肉中水分、蛋 白质、脂肪均无显著变化 (P > 0.05)，肌糖原含量 则明显下降 (P < 0.05)；随着保活时间延长，散冰 降温组在保活终期能量物质均显著低于其他降温 组 (P < 0.05)；保活 9 d 后急性、线性和梯度降温组 能量物质呈明显下降，乳酸则上升，能量代谢次序 为糖原、粗脂肪、粗蛋白。急性降温组肌肉中水分、脂肪、糖原、乳酸含量与梯度降温组相比具有显著 性差异 (P<0.05)，但蛋白质则无明显差异 (P>0.05)；线性和梯度降温组在保活 9 d 后脂肪、蛋白 质、水分均无明显差异 (P > 0.05)。结果说明，机 体在受到强应激条件下主要消耗体内储存糖原来 维持机体正常生理代谢，且胁迫强度越大，消耗糖 原越多，但短期胁迫并不会启动脂肪、蛋白质来维 持机体稳定。Bonga 等 [29]研究发现，机体一旦处于 胁迫状态，肌糖原就会被优先调动起来用于供能。随着胁迫时间延长，机体受到低温、饥饿等多重胁 迫后加速了水分的损耗，分解大量的糖原、脂肪来 维持机体平衡，但对蛋白质利用较少，且胁迫强度 越大，体内能量物质消耗的越快，这一现象在虾夷 扇贝 [30]、香港牡蛎 [15]、菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum)[31]无水流通过程中也有报道。同时也 说明，线性和梯度的降温方式更有利于牡蛎在长时 间保活中能量物质的维持。 表 3 冷胁迫方式对太平洋牡蛎无水期能量代谢的影响 Table 3 Effects of different cold stress methods on the energy metabolism of Crassostrea gigas during waterless keep alive 组别Groups 水分质量分数 粗蛋白质量分数 粗脂肪质量分数 肌糖原质量分数 肌乳酸质量摩尔浓度 Moisture mass Crude protein mass Crude fat mass Muscle glycogen Muscle lactate fraction/ % fraction / % fraction / % mass fraction / % concentration/ (μmol•g-1) 降温前Before cooling 77.75 ± 0.59a 11.53 ± 0.12a 2.59 ± 0.09b 2.28 ± 0.05a 4.63 ± 0.18c 急性组 76.96 ± 0.80a 11.50 ± 0.28a 2.46 ± 0.10b 1.76 ± 0.02c 5.70 ± 0.21b 降温后 线性组 77.33 ± 0.41a 11.28 ± 0.08a 2.53 ± 0.09b 1.98 ± 0.07b 5.67 ± 0.21b After cooling 梯度组 77.23 ± 1.02a 11.39 ± 0.23a 2.61 ± 0.07b 2.22 ± 0.03a 5.12 ± 0.15c 散冰组 78.07 ± 0.15a 11.25 ± 0.25a 2.15 ± 0.21a 1.56 ± 0.07d 7.81 ± 0.50a 急性组 保活终期 线性组 Keeping 梯度组 alive ending 散冰组 74.35 ± 0.72c 10.90 ± 0.23a 1.96 ± 0.17b 1.33 ± 0.03c 11.15 ± 0.36b 75.37 ± 0.19bc 10.99 ± 0.22a 2.09 ± 0.16ab 1.50 ± 0.06b 11.32 ± 0.30b 75.77 ± 0.60b 11.14 ± 0.30a 2.25 ± 0.06a 1.97 ± 0.04a 9.18 ± 0.31c 77.35 ± 0.75a 8.95 ± 0.37b 1.52 ± 0.05c 1.14 ± 0.04d 12.66 ± 0.57a 注：相同指标下，不同处理方式间凡含一个相同字母表示差异不显著（P ＞0.05） Note: At the same index ，the data with a same letter in different control groups means no significant difference between them （P ＞0.05） 3 结论 散冰和急性降温胁迫对牡蛎抗氧化酶活力及 脂质过氧化状态影响较大，加速了牡蛎抗氧化系统 损伤，且随着应激时间的延长对其生命体征及能量 代谢均产生显著影响。线性和梯度这两种较为缓和 的降温方式能缓解牡蛎在冰温保活过程中氧化应 激状态，短时间内有利于牡蛎抗氧化系统动态平衡 的修复，且对其生命特征及能量代谢影响更小。综 上，为减少运输损失和运输胁迫对牡蛎的健康造成 影响，建议在采用线性和梯度的降温方式诱导牡蛎 进入生态冰温状态后开始无水保活；同时可采用抗 氧化指标 (SOD 、CAT 、GSH-PX 、POD 、MDA)作 为贝类无水保活过程中的监控指标。 参考文献 [1] LIU S, LI L, WANG W, et al. Characterization, fluctuation and tissue differencesin nutrient content in thePacific oyster (Crassostrea gigas) in Qingdao, Northern China[J]. Aquaculture Research, 2020, 51(4): 1353-1364.[2] FUJITA K, SAITO M, VONGVICHITH B, et al. Analysis of the nutritional composition of aquatic species toward nutritional improvement in a Lao PDR rural area[J]. Japan Agricultural Research Quarterly: JARQ, 2019, 53(3):191-199. [3] FAN X P, QIN X M, ZHANG C H, et al. Metabolic and anti-oxidative stress responses to low temperatures during the waterless preservation of the hybrid grouper (Epinephelusfuscogutatus ♀ × Epinephelus lanceolatus ♂)[J]. Aquaculture, 2019, 508: 10-18. [4] JIANG W W, LI J Q, GAO Y P, et al. Effects of temperature change on physiological and biochemical responses of Yesso scallop, Patinopecten yessoensis[J]. Aquaculture,2016, 451: 463-472. [5]姜娓娓 ,方建光 ,李加琦 ,等 .温度胁迫对皱纹盘鲍生 理和生化活动的影响 [J].中国水产科学 ,2017, 24(2):220-230. [6]郝爽 ,张敏 .不同冷胁迫方式对缢蛏无水保活期抗氧化 酶活性及脂质过氧化的影响 [J].大连海洋大学学报 ,2020, 35(4): 584-590. [7]王潇 ,曹善茂 ,刘钢 ,等 .温度对岩扇贝无水保活及抗 氧化酶活力的影响 [J].Marine Science Bulletin,2018,20(1): 1-20. [8] XUE S Y, WANG J Y, LI J Q, et al. Effects of temperature on energy metabolism and antioxidant enzyme activities of Scapharca broughtonii[J]. Journal of Fisheries of China,2019, 43(3): 573-583. [9]山东省市场监督管理局 .地理标志产品 乳山牡蛎 :DB37/T 3928—2020[S].北京 :中国标准出版社 , 2020. [10]慕翠敏 ,孔令峰 ,于红 ,等 .太平洋牡蛎中大肠杆菌净 化的实验研究 [J].中国海洋大学学报 (自然科学版 ),2012, 42(S1): 83-86. [11]费星 ,秦小明 ,林华娟 ,等 .臭氧净化对近江牡蛎的存 活率和主要营养成分的影响 [J].食品工业科技 ,2009,30(7): 91-93. [12]储建军 .冰温保活条件下缢蛏优势腐败菌生长动力学 及耐冷机制研究 [D].杭州 :浙江工商大学 , 2017. [13]徐德峰 ,王雅玲 ,孙力军 ,等 .降温及生态冰温条件对 凡纳滨对虾无水存活时间的影响 [J].广东海洋大学学 报 , 2019, 39(6): 101-107. [14]胡益鸣 ,李琪 ,刘士凯 ,等 .温度和盐度急性胁迫对岩 牡蛎存活及免疫指标的影响 [J].中国水产科学 ,2020,27(3): 286-294. [15]高加龙 ,章超桦 ,秦小明 ,等 .不同温度无水保活对香 港牡蛎微生物和基本营养成分的影响 [J].广东海洋大 学学报 , 2020, 40(5): 90-96. [16]申淑琦 ,万玉美 ,申亮 ,等 .温度、湿度和氧气对海湾 扇贝无水保活的影响 [J].大连海洋大学学报 ,2014,29(5): 492-497. [17] ZHANG G S, MAO J Q, LIANG F F, et al. Modulated expression and enzymatic activities of Darkbarbel catfish, Pelteobagrus vachelli for oxidative stress induced by acute hypoxia and reoxygenation[J]. Chemosphere, 2016,151: 271-279. [18] LEVEELAHTI L, RYTKÖNEN K T, RENSHAW G M C, et al. Revisiting redox-active antioxidant defenses in response to hypoxic challenge in both hypoxia-tolerant and hypoxia-sensitive fish species[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2014, 40(1): 183-191. [19]陈丽梅 ,刘利华 ,胡宏辉 ,等 .温度突变对毛蚶不同组 织抗氧化酶活性的影响 [J].水产科学 ,2019, 38(4):435-442. [20]刘玲 ,陈超 ,李炎璐 ,等 .短期温度胁迫对驼背鲈 (♀)×鞍带石斑鱼 (♂)杂交子代幼鱼抗氧化及消化酶活性 的影响 [J].渔业科学进展 , 2018, 39(2): 59-66. [21] DUAN Y F, ZHANG J S, DONG H B, et al. Oxidative stress response of the black tiger shrimp Penaeus monodon to Vibrio parahaemolyticus challenge[J]. Fish &Shellfish Immunology, 2015, 46(2): 354-365. [22]李晓英 ,董志国 ,阎斌伦 ,等 .青蛤 POD 组织差异及温 度骤升和窒息胁迫对青蛤 POD 的影响 [J].海洋通报 ,2010, 29(5): 521-525. [23] VÍCTOR V M, ESPULGUES J V, HERNÁNDEZ-MIJARES A, et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Sepsis: a potential therapy with mitochondria-targeted antioxidants[J]. Infectious Disorders Drug Targets, 2009, 9(4): 376-389. [24]杜可 ,林岗 ,李惠莲 ,等 .低温胁迫对三沙湾华贵栉孔 扇贝生理指标的影响 [J].福建师范大学学报 (自然科学 版 ), 2021, 37(6): 62-69. [25]郝爽 ,张敏 ,方佳琪 .缢蛏在急性温度胁迫下的氧化应 激响应及生理代谢变化 [J].上海海洋大学学报 ,2021,30(2): 214-221. [26] GIESEG S P, CUDDIHY S, HILL J V, et al. A comparison of plasma vitamin C and E levels in two Antarctic and two temperate water fish species[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, Biochemistry &Molecular Biology, 2000, 125(3): 371-378. [27]曹善茂 ,王潇 ,刘钢 ,等 .温度胁迫对岩扇贝幼贝抗氧 化酶活力的影响 [J].大连海洋大学学报 ,2018, 33(2):223-227. [28] GU Z F, WEI H J, CHENG F, et al. Effects of air exposure time and temperature on physiological energetics and oxidative stress of winged pearl oyster (Pteria penguin)[J]. Aquaculture Reports, 2020, 17: 100384. [29]WENDELAARBSE.Thestressresponseinfish[J]. Physiological Reviews, 1997, 77(3): 591-625. [30]陈文秀 ,欧阳杰 ,徐文其 ,等 .贮藏条件对活品虾夷扇 贝营养及品质的影响 [J].渔业现代化 ,2019, 46(6):83-89. [31] BI S J, XUE C H, SUN C, et al. Impact of transportation and rehydration strategies on the physiological responses of clams (Ruditapes philippinarum)[J]. Aquaculture Reports, 2022, 22: 100976. （责任编辑：刘朏）