丹参中活性成分检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA22-195Excellence in Science Excellence in ScienceLC-303 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.-Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 全谱二维液相色谱检测丹参中的活性成分 LC-303 摘要：本文利用岛津全谱二维液相色谱系统，建立了一针进样分析丹参中脂溶性和水溶性活性成分的液相色谱方法。相对于2020年版《中华人民共和国药典》需要分两个方法进行分析，本方法仅用21 min， 不仅可以实现丹参酮Ⅱ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹酚酸B的同时分离，同时分离度良好，满足药典要求。方法学验证结果表明，四种成分在线性范围内相关性良好，线性相关系数均大于0.999；连续6次重复进样分析中，四种成分的保留时间的 RSD 在0.018%-0.085%之间，峰面积的RSD 在 0.10%-0.38%之间，说明本方法稳定性良好。加标回收实验，四种成分的加标回收在 89.63%-118.15%之间， RSD 在 0.31%-4.99%之间。使用本方法检测某丹参样品含量，平行六次分析结果的 RSD 在 2.64%-4.31%之间。通过本例，展示了全谱二维液相色谱在不同极性天然产物分析中的应用。 丹参首载于《神农本草经》，是中国的传统中药，其有效成分主要包括两大类，分别是水溶性丹参酚酸类和脂溶性丹参酮类。①水溶性丹参酚酸类：丹参素、丹酚酸类化合物及迷迭香酸等成分。②脂溶性丹参酮类：主要包括丹参酮Ⅰ、异丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮及去氢丹参酮Ⅱ等成分。2020年版《中华人民共和国药典》规定了丹参中的主要脂溶性和水溶性活性成分含量测定的方法，采用高效液相色谱法，分两个方法进行分析。 岛津全谱二维液相色谱系统，小可以实现一针进样实验部分 1.1仪器 岛津全谱二维液相系统。具体配置为 输液泵： LC-40B XR， LC-40B X3 自动进样器：SIL-40C X3 系统控制器：SCL-40 检测器： SPD-M40 同时分析高、中、低极性物质，不仅可以将相同分离模式进行组合，还可以将不同分离模式如亲水作用色谱模式(HILIC)和反相液相色谱模式(C8或者C18)的组合，是非常有应用前景的分离分析技术。 本文通过优化中心切割条件及柱头聚焦条件，成功建立了丹参提取液中脂溶性活性成分和水溶性活性成分的一针进样分析方法。该方法不仅分离度满足药典要求，同时还有分析时间短、线性范围宽、定量准确度高的优点。 在线脱气机： DGU-20A5 柱温箱：CTO-40C 切换阀： FCV-36AH ( 色谱工作站： Lab S olutions Ver. 5.97 ) 图1 全谱二维液相系统示意图 (1：一维液相输液泵A；2：一维液相输液泵B；3：二维液相输液泵A；4：二维液相输液泵B；5：三通混合器；6：自动进样器； 7：色谱柱1；8：高压十十阀；9：500uL样品环；10：三通混合器；11：色谱柱2；12：检测器) 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：第一维： Shim pack GIST 100 mm×2.1 mml.D.， 2um (P/N：227-30001-04，岛津(上海)实验器材有限公司) 第二维： Shim-pack GIST-HP C18-AQ 100 mm×2.1 mml.D.， 3 um (P/N： 227-30765-03岛津(上海)实验器材有限公司) 流动相：第一维：A相-0.02%磷酸水溶液；B相-乙腈 第二维：A相-0.1%磷酸水溶液；B相-乙腈 柱温：20℃ 进样体积：4uL 洗脱方式：梯度洗脱，时间程序见表1-表3。 表1 一维液相色谱梯度洗脱时间程序 时间 (min) 流速 泵A浓度 泵B浓度 0.00 0.4 45 55 3.00 0.4 45 55 10.00 0.4 10 90 10.10 0.4 45 55 表2 二维液相色谱梯度洗脱时间程序 时间(min) 流速 泵A浓度 泵B浓度 0.00 0.4 80 20 1.10 0.4 80 20 1.11 0.5 80 20 8.11 0.5 80 20 8.12 0.4 80 20 18.12 0.4 50 50 18.20 0.4 80 20 表3 其他时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 1.1 柱温箱 Oven Valve 2 1 9.5 柱温箱 Oven Valve 2 0 21 控制器 Stop 1.3对照品溶液的配置 准确称取丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹酚酸B对照品粉末，置于容量瓶中，加甲醇分别定容到1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL和2mg/mL， 为储备溶液。取适量的储备溶液用甲醇稀释至指定浓度，上机分析。 1.4供试品溶液制备 准确称取丹参样品粉末(过三号筛)约0.15g， 置具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇50mL， 密塞，称定重量，超声处理(功率140W， 频率42 kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用90%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得 加标样品制备：准确称取丹参样品粉末(过三号筛)约0.15g，置具塞锥形瓶中，加入丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹酚酸B对照品溶液适量，精密加入90%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率140 W，2 kHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用90%甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 结果与讨论 2.1液相色谱方法参数优化 2.1.1一维液相条件确认 本应用首先分别针对丹参酮类物质和丹酚酸B进行一维液相色谱条件优化和确认，主要优化色谱柱和梯度条件。丹参酮类物质液相色谱方法优化时，通过微调梯度条件，丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的分离度良好，如图2所示，相对保留时间见表4，满足药典中相对保留时间规定值的±5%范围之内的要求。 图2丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ一维液相色谱图(浓度5.0 ug/mL) 表4丹参酮类化合物保留时间 # 待测成分 保留时间 相对保留时间 药典规定相对保留时间 药典规定参考范围 1 隐丹参酮 6.155 0.728 0.75 0.7125-0.7875 2 丹参酮1 6.741 0.797 0.79 0.7505-0.8295 3 丹参酮Ⅱ 8.460 1.00 1.00 丹酚酸B液相色谱方法优化，主要对比了1.9 um 和3.0 um 的色谱柱，由于柱温较低，1.9 um的色谱柱虽然有更好的柱效，但是背压更高，因此选择3.0 um 的色谱柱用于丹酚酸B的分离。丹酚酸B的分离采用梯度洗脱，通过实验验证，丹酚酸B在色谱柱上保留较强，满足柱头聚焦的要求。 图3 丹酚酸B液相色谱图(浓度100.0pg/mL) 2.1.2二维柱头聚焦条件优化——聚焦体积 在全谱二维系统的分析过程中，丹酚酸B从第一维经定量环导入到第二维，并经历了较长时间的柱头稀释聚焦，因此有必要对柱头聚焦条件进行优化以达最佳的聚焦效果。聚焦体积定义为二维液相中利用有机相将目标物从定量环中携带出来的体积。以10%为稀释比例，当聚焦体积随聚焦时间延长而增加，考察峰面积随聚焦体积的变化规律，见图4。由图可知，当聚焦体积≥800uL时，峰面积达到稳定。 图4 丹酚酸B峰面积与聚焦体积的变化趋势、峰高与聚焦比例的变化趋势 2.1.3二维柱头聚焦条件优化——聚焦比例 聚焦比例对二维色谱分析的聚焦时间和分离结果都有很大影响，因此，聚焦比例也是二维聚焦条件的核心参数。以800 uL为聚焦体积，在不同稀比比例的条件下，考察丹酚酸B的峰宽、峰高等基本参数，结果见图4。由图可知，随着聚焦比例增加，丹酚酸B的峰宽显著变宽，峰面积也随之减小，说明聚焦比例过时丹酚酸B在色谱柱上有一定程度的洗脱，而导致聚焦效果变差。聚焦比例较小，虽然聚焦效果良好，但是会大幅延长聚焦时间，不同聚焦比例下对应的聚焦时间见表5。因第一维色谱分离中丹参酮Ⅱ的保留时间为 8.460 min， 聚焦时间大于 10 min时则会增加全谱二维液相系统的分析时间，因此20%和25%的聚焦比例均比较理想。 表5不同聚焦比例下聚焦时间变化 聚焦比例 10% 15% 20% 25% 聚焦时间 20 min 13.3 min 10 min 8 min 聚焦比例同时也是二维液相色谱梯度分析的起点，因此聚焦比例直接影响二维液相色谱梯度变化，进而影响分离效果。通过对比丹酚酸B(峰2)对照品溶液中主峰和附近杂质峰(峰1和峰3)的分离度，见图6聚焦比例为20%条件下，丹酚酸B和杂质峰的分离度稍好，考虑实际样品更为复杂，需要更好的分离效果，因此确定聚焦比例为20%。 表6丹酚酸B和杂质峰的分离度 峰号 20%聚焦比例 25%聚焦比例 1 -- -- 2 3.523 3.121 3 5.791 5.511 图5 20%聚焦比例聚焦比例的色谱图 2.1.4二维柱头聚焦条件优化——聚焦流速 聚焦流速直接决定了柱头聚焦的时间，提升流速可以直接接短聚焦时间，甚至提前开始梯度分析，，可以大幅缩短整个的分析时间，但是提升流速也直接带来了背压升高，因此本文仅考察0.4 mL/min， 0.5 mL/min 和 0.6mL/min的聚焦流速。实验数据显示，三种聚焦流速对分离效果没有显著影响，选择0.5 mL/min 流速为最终聚焦流速。 2.2色谱图 通过优化上述条件，确认最终液相色谱方法，21 min 完成丹参中高级性活性成分和中低极性活性成分的同时分析。 图6 丹参活性成分对照品的色谱图 (丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ，检测波长270nm， 浓度为 20 ug/mL；丹酚酸B，检测波长286nm， 浓度为 100 ug/mL) 2.3提取条件优化 由于丹参中活性成分的极性跨度较大，必须针对不同极性的成分优化提取条件，才能保证目标成分能够有效提取，保证定量结果的准确性。本文对比了100%甲醇、90%甲醇水溶液和80%甲醇水溶液的提取结果，通过对比四种目标物的峰面积，选取提取效果最好的提取溶液，如图7所示，四种目标成分在90%甲醇水溶液中均有良好的提取效率。 图7 丹参活性成分在不同提取溶液中的峰面积 2.4方法学验证 2.4.1重复性 按照1.3和1.4所述准备对照品溶液和供试品溶液，其中对照品溶液中丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的浓度为 20 ug/mL， 丹酚酸B的浓度为 100 ug/mL。 两份溶液均连续进样6次，计算四种成分保留时间和峰面积的重复性，并统计相对标准偏差 (RSD%)。结果表明，四种成分的保留时间的 RSD 在 0.018%-0.085%之间，峰面积的 RSD 在 0.10%-0.38%之间，说明本方法稳定性良好。 表7 对照品溶液和供试品溶液的重复性(n=6) # 成分 对照品溶液 供试品溶液 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 隐丹参酮 0.085 0.27 0.052 0.38 2 丹参酮 0.068 0.31 0.045 0.36 3 丹参酮Ⅱ 0.042 0.28 0.032 0.10 4 丹酚酸B 0.018 0.17 0.022 0.53 2.4.2校准曲线 按1.4所述方法配制系列对照品混合标准溶液，以各对照品的色谱峰峰面积(y)对进样质量浓度(x， ug/mL) 进行回归计算，4种对照品的线性关系，线性回归方程及相关系数(r)如表8所示，4种对照品在线性范围内线性相关性良好，相关系数r均在0.999以上。 表8 四种对照品的校准曲线及线性范围 # 成分 线性范围 ug/mL 校准曲线 相关系数 准确度% 1 隐丹参酮 0.1-50.0 Y=(73888.5)X+(-1200.88) 0.9999 98.2-106.3 2 丹参酮I 0.1-20.0 Y=(29648.1)X+(-1131.19) 0.9992 94.2-115.5 3 丹参酮Ⅱ 0.1-50.0 Y=(63635.2)X+(-548.227) 0.9999 99.2-103.2 4 丹酚酸B 1.0-500.0 Y=(12622.2)X+(333.099) 0.9999 98.2-108.8 2.4.3实际样品含量检测 按照上述方法，对丹参样品进行检测，平行6次实验，所得溶液上机分析，结果如图8和表9所示。结果显示，4种成分的含量在 0.43 mg/g-57.06mg/g之间， RSD 在 2.64%-4.31%之间。 图8 丹参样品色谱图 (丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ，检测波长270nm；丹酚酸B，检测波长286 nm) 表9丹参样品检测结果(n=6) # 成分 含量(mg/g) RSD(%) 隐丹参酮 0.43 4.21 丹参酮| 0.50 3.68 3 丹参酮Ⅱ 1.53 3.79 4 丹酚酸B 57.06 2.64 2.4.4加标回收 向2.4.3中已测得含量的丹参样品中按照低、中、高三个浓度水平分别加入适量的对照品溶液，按照1.4方法制备加标样品，每个浓度水平平行3次实验，所得溶液上机分析，并计算回收率。实验结果显示4种成分的加标回收在 89.94%-117.40%之间， RSD 在 0.31%-4.99% 之间。 表10.0丹参中4种成分的加标回收率(n=3) # 成分 样品含量· 加标浓度1 加标浓度2 加标浓度3 加标量 回收率 RSD 加标量 回收率 RSD 加标量 回收率 RSD mg/g mg/g % % mg/g % % mg/g % % 1 隐丹参酮 0.43 0.33 97.30 0.42 0.67 97.20 0.64 1.00 98.92 0.31 2 丹参酮1 0.50 0.33 114.00 3.24 0.67 117.40 3.95 1.67 101.02 4.99 3 丹参酮Ⅱ· 1.53 0.83 100.32 0.49 1.67 102.28 0.91 3.33 89.94 0.57 4 丹酚酸B 57.06 11.67 108.80 3.08 16.67 116.43 4.00 33.33 98.87 4.39 2.5与常规液相方法对比 根据《中药材高效液相色谱检定》中收录的丹参品种色谱图显示，按照药典标准方法，脂溶性成分需要40min完成分析，而水溶性成分需要 50 min 完成分析，合计需要 90 min 的分析时间。利用全谱二维液相建立的一针分析方法，仅需 21 min 即可完成4种成分的同时分析，效率提升了4.5倍，同时分离度满足药典要求。 图10药典中丹参品种的高效液相色谱图 (A：丹参酮Ⅱ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ，检测波长270nm； B：丹酚酸B，检测波长286 nm) 结论 本文利用岛津全谱二维液相系统，建立了一针进样分析丹参样品中脂溶性和水溶性活性成分的液相色谱方法。本方法仅用 21 min， 不仅可以实现丹参酮Ⅱ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹酚酸B的同时分离，同时分离度良好，满足药典要求。方法学实验中，4种成分的线性相关性、重复性和加标回收均良好，同时还用该方法计算了丹参样品中4种成分的含量。本方法具有分析时间短、线性范围宽、定量准确度高的优点，可用于丹参中含量量定，供相关人员参考。通过本例，展示了全谱二维液相色谱在不同极性天然产物分析中的应用。 岛津应用云 本文利用岛津全谱二维液相系统，建立了一针进样分析丹参样品中脂溶性和水溶性活性成分的液相色谱方法。本方法仅用21min，不仅可以实现丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹酚酸B的同时分离，同时分离度良好，满足药典要求。方法学实验中，4种成分的线性相关性、重复性和加标回收均良好，同时还用该方法计算了丹参样品中4种成分的含量。本方法具有分析时间短、线性范围宽、定量准确度高的优点，可用于丹参中含量测定，供相关人员参考。通过本例，展示了全谱二维液相色谱在不同极性天然产物分析中的应用。