面粉中淀粉酶活力检测方案(紫外分光光度计)

TEL-400-616-4686 面粉中淀粉酶的固态发酵实验的应用方案 原理里粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a-1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质))，还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在美析UV1500分光光度计 540 nm 波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量，，从而求出淀粉酶活力。 材料与仪器 美析UV1500分光光度计 麸皮面粉KH2PO4V4 NaNO3 ((NH4)2SO4 CaCl2NMgSO4·7H20 CoCl2 FeSO4·7H2O ZnSO4恒温水浴锅生化培养箱磁力搅拌器居三角瓶 步骤 1.还原糖的测定 (1)标准曲线的制作 取9支干燥试管编号，按表1所示的量，，精确浓度为1.00 mg/ml 的葡萄糖标准液和3，5-二硝基水杨酸试剂。表中单位为 ml。 将各管摇匀，盖上小漏斗，在沸水浴中加热5 min， 立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水至 20.5 ml，用橡皮塞塞住管口，混匀。切勿用力振摇，以免引入气泡。在 540 nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测定1-8号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 表1还原糖标准曲线制作 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 加入试剂 葡萄糖标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.4 0 3、5一二硝基水杨酸试剂 3 3 3 3 3 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 上海美析仪器有限公司 (2)发酵液中残留还原糖的测定 发酵液单层滤纸过滤，，2滤液0.2ml定容至100 ml，500倍稀释至含糖量 2-8mg/100ml为试样。 取4支干燥试管，编号，按表2所示的量，，精确加入待测液和试剂(ml)试剂加入后，其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同，测定出各管溶液的吸光度值。 计算 以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算样品中还原糖的百分含量： 提取液总体积标准曲线上查得的还原糖克数×测定还原糖 测 定 时 取 液 体 积 样品毫克数 表2还原糖的测定 管号 项目 空白 还原糖 0 1 2 3 样品量 0 2.0 2.0 2.0 蒸馏水 2.0 0 0 0 3、5一二硝基水杨酸试剂 3 3 3 3 总体积 5.0 5.0 5.0 5.0 2.氨基态氮的测定 (1)取发酵滤液5.00 ml， 置于100ml烧杯中，加入15ml水，磁力搅拌器搅拌 5 min 后，将电位计插入烧杯中，用0.1 mol/LNaOH标准溶液滴定至酸度计指示 pH=8.20，此为游离酸度，不予计量。加入 10.0ml甲醛溶液，立即混匀，迅速用 0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定至酸度计指示 pH=9.20，计下消耗 NaOH 标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。 (2)计算 氨基氮(%)=(V-Vo) xNx0.014×20/5×100 式中： V--加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积， ml； Vo--加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积， ml； M--NaOH 标准溶液的浓度，mol/L； 0.014--与1.00ml NaOH标准溶液相当的氮的质量，，g， (3)淀粉酶活力的测定及计算 淀粉酶活力]((IU/g干培养基))：本实验条件下，每分钟释放出1umol 还原糖所需要的酶称为一个酶活力单位。 上海美析仪器有限公司 Mxt 其中： n一稀释倍数： v一浸提比(=L/g干培养基)： k一一刹率： M--葡萄糖的分子量： t一一反应时间(10min) ： 1000--转换系数 对照 样品1 样品2 样品3 底物(mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液(mL) 0 0.5 0.5 05 沸水浴10min DNS(mL) 3 3 3 3 酶液(mL) 0.5 0 0 0 蒸馏水 加蒸馏水至20.5mL 550nm 处测OD值 OD： OD、 OD： (4))L总体实验操作流程： ①配制培养基，灭菌，冷却。 ②冷却后接种，并搅拌均匀，置于28℃培养箱进行培养。 ③每隔24h取样，用0.2M磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0)按一定的浸提比进行浸提1h，离心得粗酶液。共取样6次。 ④分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。 三、实验结果 1.以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。 2.以氨基态氮浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。 3.以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐坐，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。 仪器参数 UV-1500UV-1500PC 紫外可见分光光度计 采用单片微机控制，128*64位液晶显示 宽大的液晶显示器可显示多组数据 自动调0、调100%功能 波长自动调节 光源自动切换，滤色片自动切换 宽大样品品(5mm~100mm) 波长重现性 s0.2nm 检测器 进口硅光二极管 透射比准确度±0.3%T 光源 进口氘灯，进口钨灯 透射比重现性0.15%t 电源 AC 220V/50Hz或110V/60Hz 杂散光 s0.05%t(220nm NaI ， 340nm NaNo2) 功率 120W 稳定性 0.001A/h(500nm预热后) 仪器尺寸 480×350×220mm 测光方式 透过率、吸光度、浓度、能量 主机净重 15Kg 主机1台 011cm石英比色皿2只 1cm玻璃比色皿4只 防尘罩1只 E电源线1柜 使用说明书1本 软件套装(UV-1500选配，UV-1500PC标配) 上海美析仪器有限公司 08 TEL：400-616-4686|http：//www.macylab.com 关于我们 上海美析仪器公司简介 上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的仓业理念“科技——因你改变”，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。 上海美析仪器有限公司 美析主营光谱类仪器可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、超微量分光光度计、原原荧光光度计、ICP电感耦合等离子体发射光谱仪、ICP 电感耦合等离子体质谱仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。美析的总部及生产基地设在上海，营销中心设在北京，并在江苏、上海、山东三地建有研发基地。为充分利用各地的智力资源，美析与国内外的部分科研单位也进行了深层次的科研合作，不断将科研成果转化为生产力。为更好的服务于广大客户，美析仪器国内设有12家办事机构，度身定制符合您需求的应用解决方案，提高产品的附加值。在不断服务国内用户的同时，美析也与20多个国家的分销机构建立了深度的战略合作关系。 (美析仪器不仅仅只是一家高新技术认证企业，更通过了 CE 认证、FCC 认证、RoHS 认证以及国内多项资质审查认证，并有着多项自行研发的光谱类专利版权等等) 上海美析仪器有限公司 淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在美析UV1500分光光度计540 nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量，从而求出淀粉酶活力。