曲妥珠单抗中肽图分析检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-771Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-027 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 利用岛津高效液相色谱与单四极杆质谱联用系统对曲妥珠单抗进行肽图分析 LCMS-027 摘要：本文采用岛津 Nexera LC-40 高效液相色谱仪及单四极杆质谱 LCMS-2020 联用对曲妥珠单抗的胰蛋白酶酶解样品进行分析，配套使用多肽分析专用色谱柱进行分离，利用紫外检测器和质谱进行检测，质谱检测结果对关键色谱峰进行定位。该方法重复性实验中，各肽段的保留时间 RSD 为 0.04-0.22%；峰面积 RSD 值为0.46-1.88%。实验结果表明，该方法方便快捷，具有良好的重复性。 关键词： Nexera LC-40LCMS-2020曲妥珠单抗肽图 曲妥珠单抗(Trastuzumab)，是抗ErbB2/HER2(原癌基因人类表皮生长因子2)的单克隆抗体类生物药，为重组人源化单克隆抗体。曲妥珠单抗被广泛应用于各期 HER-2阳性乳腺癌的治疗，于1998年被美国FDA批准，是第一个抗 HER-2的人源化单克隆抗体。 随着科技发展与国家政策扶持，生物药因具有相比其他药品安全性高、毒性小、营养价值高等特点而不断繁荣起来，而日益严格的各项法规要求让我们对生物药结构研究、特性分析与质量控制也有了更高的要求。 HPLC肽图分析是蛋白类生物药一级结构研究中极为重要的手段之一，不但可以比较生物类似药与原 研药一级结构的一致性，确认基因工程上游和下游处理过程中是否发生差错、重组产物中是否存在翻译后修饰及未预期氨基酸的变异等，而且不同批次产品的肽谱比较可验证工艺过程的稳定性。因此，肽谱分析在生物技术药物质控中尤为重要。 本实验以曲妥珠单抗为例，使用高效液相色谱仪Nexera LC-40 与单四极杆质谱仪 LCMS-2020联用系统对曲妥珠单抗肽图进行分析(通过质谱图辅助定性)，实验结果表明 Nexera LC-40 高效液相色谱系统在进行肽图分析实验时重复性良好，可用于日常蛋白类生物药质控中的肽图分析检测项目。 1.1仪器 高效液相色谱系统 Nexera LC-40与单四极杆质谱仪 LCMS-2020联用系统，配置信息如下： 系统控制器：SCL-40A 自动进样器： SIL-40C XR 输液泵： LC-40BXR 柱温箱： CTO-40C 脱气机： DGU-405 质谱仪： LCMS-2020 检测器： SPD-M40A 色谱工作站： Labsolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GISS-HP C18 (100mm×2.1mm l.D.， 3.0um， 岛津(上海)实验器材有限公司岛津，P/N：227-30084-02，) 流动相：A，0.1%甲酸水溶液；B，0.1%甲酸乙腈溶液 流速： 0.4 mL/min柱温：50℃进样体积：10uL检测波长：214nm，280nm 洗脱方式：梯度洗脱，B相起始浓度为3%，时间程序如表1所示。 表1 梯度洗脱时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 2.00 泵 B Conc 3 50.00 泵 B Conc 50 51.00 泵 B Conc 90 56.00 泵 B Conc 90 56.10 泵 B Conc 3 60.00 控制器 Stop 质谱条件 分析仪器：LCMS-2020离子化模式： ESI+加热块温度：400CDL温度：250℃雾化气流速：3.0L/min干燥气流速：10.0L/min 接口电压：4.5kV 扫描模式： scan 样品前处理 供试品溶液制备：吸取5 uL 2.0 mg/mL 的曲妥珠单抗水溶液于1.5 mL的离心管中，加80 uL还原溶液(50 mM Tris-HCI， 含8M尿素和5mM DTT (二硫苏糖醇))，在37℃下震摇60 min， 结束后加入4 uL IAA(碘乙酰胺)溶液(500mM)，，在室温条件下避光震摇30 min，然后加入600 uL酶解缓冲液(50mM Tris-HCI)和5uL胰蛋白酶溶液(含1ug胰蛋白酶)，在37℃下反应4h，酶解结束后加入10 uL 50%甲酸水溶液终止酶解反应，然后转入低吸附PP 材质的样品小瓶上机分析。 结果与讨论 3.1曲妥珠单抗酶解液色谱图 图1 曲妥珠单抗酶解液TIC图 图2 曲妥珠单抗酶解液在280 nm 处的色谱图 图3 曲妥珠单抗酶解液在214nm 处的色谱图 3.2重复性实验 按照1.2分析条件测定，将处理后的曲妥珠单抗酶解液连续进样测定6次(图4和5)。通过质谱结果对各峰进行定位，部分肽段序列信息及其保留时间请见表2。液相色谱图各峰的保留时间 RSD 值为 0.04-0.22%；峰面积 RSD 值为 0.46-1.88%，结果见表2所示。实验结果表明， Nexera LC-40 系统在进行肽图分析是具有良好的精密度。 图4 波长280 nm处重复生色谱图 图5 波长214 nm 处重复性色谱图 表2 部分肽段保留时间及峰面积RSD 汇总 Peak 对应肽段 平均保留时间 RSD% 平均峰面积 RSD% (min) (保留时间) (峰面积) Peak 1 LLIYSASFLYSGVPSR.light 13.320 0.22 7645 0.50 Peak 2 LSC[+57.021464]AASGFNIK.light 18.098 0.08 3987 0.62 Peak 3 ASQDVNTAVAWYQQKPGK.light 18.905 0.07 18506 0.49 Peak 4 DIQMTQSPSSLSASVGDR.light 19.917 0.05 3073 0.83 Peak5 DIQMTQSPSSLSASVGDRV 23.232 0.04 16219 1.88 TITC[+57.021464]R.light Peak 6 TTPPVLDSDGSFFLYSK.light 27.349 0.06 6915 0.62 Peak 7 SGTASWVC[+57.021464]LLNNFYPR.light 32.237 0.08 44544 0.51 Peak 8 ALPAPIEK.light 15.725 0.10 47343 0.46 结论 本实验使用岛津高效液相色谱仪 Nexera LC-40 与单四极杆质谱仪 LCMS-2020 联用系统对曲妥珠单抗酶解液进行分析，重复性实验中，色谱图各峰保留时间 RSD 值为 0.04-0.22%；峰面积 RSD 值为 0.46-1.88%，仪器重复性良好。实验结果表明岛津 Nexera LC-40高效液相色谱仪分析速度快、稳定性良好，适用于制药药检相关行业对生物药质量控制和分析的检验检测工作，能为生物药的质量控制检测项目(肽图分析)提供一个经济高效且简便的解决方案。 岛津应用云 本实验使用岛津高效液相色谱仪Nexera LC-40与单四极杆质谱仪LCMS-2020联用系统对曲妥珠单抗酶解液进行分析，重复性实验中，色谱图各峰保留时间RSD值为0.04-0.22%；峰面积RSD值为0.46-1.88%，仪器重复性良好。实验结果表明岛津Nexera LC-40高效液相色谱仪分析速度快、稳定性良好，适用于制药药检相关行业对生物药质量控制和分析的检验检测工作，能为生物药的质量控制检测项目（肽图分析）提供一个经济高效且简便的解决方案。