药物中石墨烯洗涤优化检测方案(微滤系统)

SARTORIUS应用说明 结论 2021年7月1日 关键词或短语：氧化石墨烯、洗涤、中和、离心、切向流过滤 作为药物传递载体使用之前石墨烯的洗涤优化方案 Abdelnour H. Alhourani，* John Cashman，Klaus Schone ' Department of Chemistry， Bioscience and Environmental Engineering， University of Stavanger， Stavanger， NorwaySartorius UK Ltd.， Epsom， United Kingdom Sartorius Lab Instruments GmbH & Co.KG， Gottingen， Germany *通讯 电子邮箱： abdelnour.alhourani@uis.no 摘要 由于具有超高表面积和功能，石墨烯适用于许多生物医学应用(包括基因和药物递送)。在氧化石墨烯(GO)生产工艺之后，需要洗涤以中和并去除杂质。使用离心机方法既费力又费时。本文描述了一种使用Vivaflow@ 50(100 kDa MWCO)通过切向流过滤(TFF)洗涤氧化石墨烯分散体以快速中和pH值的改进方法。与常规离心相比，采用TFF时所需的时间显著缩短且氧化石墨烯回收率较高。 引言 石墨烯是一种具有单原子厚度的碳同素异形体，呈六方晶格结构(2D单层)，从石墨晶体中分离得到。12现已研究将该物质用于许多生物医学应用，包括基因和药物递送1.3、光热疗法4和细胞成像。石墨烯的独特表面(在超高表面积中包含离域电子1)能够通过n-n相互作用有效加载疏水性药物。3.6 最常用的一种石墨烯类型是氧化石墨烯，其采用Hummers方法生产而成(使用化学方法通过氧化作用将石墨剥离成单片)。然而，生产后需要进行长时间处理以去除污染物(包括钾和硫化物杂质)并中和片材的高酸度。此工艺通常采用多个离心步骤，每个步骤耗时4至10小时。整个工艺通常总计耗时长达一周2.78，对于较大批量而言离心机容量也是一项限制因素。对于生物医学应用，氧化石墨烯的pH值调节对于与生物系统的相容性至关重要。由于氧化石墨烯具有pH值依赖性双亲性， pH值在药物释放中也发挥重要作用。9.10 在本研究中，我们的目的是在去除污染物和调节氧化石墨烯pH值方面开发一种改进的更高效工艺。使用Vivaflow@可实现稳健、实验室规模切向流过滤(TFF)，从而提供了一种能够进行显著更快且便捷处理的经济解决方案(图1)。 材料和方法 横流系统(例如Vivaflow@)中的切向流有助于最大程度地减少膜污染并能够处理更大批量。作为Vivaflow@系统一部分提供的样品杯可实现简单缓冲液置换，同时保持恒定样品体积，并且可轻松实施超声处理以防石墨烯片聚集(此为该纳米材料的一项特征，可能会影响有效洗涤和pH值调节)。Vivaspin@6离心浓缩管的初始实验表明， PES膜会迅速受到石墨烯污染(未显示数据)。因此，我们选择具有100kDaMWCO再生纤维素(RC)膜的Vivaflow@50与离心方法进行比较性研究。 离心和TFF的方法比较(第一项实验) 为通过离心法调节氧化石墨烯分散体的pH值，向50mL离心管中填充100pg/mL氧化石墨烯，温和超声处理10分钟(在声波浴中)，然后以4，696g离心1h或10h。倒出上清液，用超纯水(Arium@)重悬石墨烯沉淀。测量pH值和浓度(采用紫外-可见光谱法在660nm波长处测量)且此过程重复执行七次，包括使用50%v/v乙醇进行一次洗涤(第五次)。 为使用Vivaflow@通过TFF法调节氧化石墨烯的pH值，取相对体积为400mL(相当于采用离心方法时8x50mL管)的100ug/mL氧化石墨烯添加到Vivaflow@样品杯中，对该样品杯保持温和超声处理(在声波浴中)。使用具有100kDa MWCO RC膜的Vivaflow@50膜包(操作压力为2.5 bar[在出口处测量])，通过超纯水(Arium@)透析法洗涤氧化石墨烯片材。每经1升透析(2.5x置换体积)后，取10mL样品测量pH值和浓度(采用紫外-可见吸光度法)，然后将这些样品放回样品杯中进行后续透析步骤。总计使用7x1升置换溶剂洗涤石墨烯，除第五步骤使用50%v/v乙醇外，所有其他步骤均使用水。 使用Vivaflow@通过TFF法洗涤氧化石墨烯(第二项实验)为证实重复精度，制备浓度为100ug/mL的氧化石墨烯分散体。测得pH值为3.5。其中每项洗涤实验(按一式两份实施)均使用250mL氧化石墨烯分散体。置换1升Arium@超纯水(4倍置换体积)后，从样品杯中取10mL样品并测量吸光度(用于测定氧化石墨烯浓度)和pH值。在过滤工艺结束时再取10mL样品。其涵盖另外一升由250mL50%(v/v)乙醇和750mLArium超纯水组成置换溶液(总计8倍置换体积)。测量样品吸光度和pH值。 氧化石墨烯离心和TFF洗涤的回收率和时间比较 图2：氧化石墨烯分散体 (400mL， 100ug/mL)洗涤方法在洗涤工艺后的氧化石墨烯回收率和达到中性pH值所需的总时间方面的比较(n=1)。离心(短时)=7个循环，每个循环步骤持续1小时；离心(长时)=7个循环，每个循环步骤持续10小时； TFF (Vivaflow) (实施连续缓冲液置换)。 在第一项实验中(图2)，比较了400mL氧化石墨烯(100ug/mL)的三种洗涤方法达到中性pH值的时间和氧化石墨烯回收率：1)1小时旋转离心(短时)；2)10小时旋转离心(长时)；3)切向流过滤TFF。采用1小时离心步骤时，起始氧化石墨烯物料的pH值从约4.5调节至6。然而，如此的短时旋转对石墨烯的回收率产生严重不利影响，原因是上清液发生显著损失-特别是较小片材(在药物递送应用中最为有用)。测得回收率约为起始物料总量的16%。将各离心步骤的时长增至10小时，显著提高了回收率(93%)但所带来的不良影响是工艺时长约为200小时。Vivaflow@能够在10.5小时内中和氧化石墨烯的pH值，每一透析步骤约需90分钟。测得氧化石墨烯回收率为97%。 在第二项实验中(图3)，使用TFF洗涤浓度为100pg/mL的250mL氧化石墨烯。在开始时及在洗涤溶液达到4倍和8倍置换体积后测量pH值和氧化石墨烯回收率，以绘制工艺进度图。在洗涤用置换体积达到初始样品体积的8倍(即2升)后，pH值可达到6.9。测得氧化石墨烯平均回收率为81%。此回收率略低于第一项试验，除实验变化外，还可通过较低初始样品体积(其中污染吸附影响更为明显)予以解释。 通过TFF (Vivaflow) 法洗涤氧化石墨烯：回收率和pH值 图3：使用MWCO为100kDa的Vivaflow@TFF膜包(RC膜)洗涤氧化石墨烯分散体 (100ug/mL) 以达到中性pH值。按洗涤溶液的置换体积(250mL这一进给体积的倍数)显示氧化石墨烯的回收率和分散体的pH值(n=2)。 比较了以下三种用于中和氧化石墨烯的洗涤方法并绘制了采用TFF法时pH值和回收率的时程：采用短时步骤进行离心、采用长时步骤进行离心、使用Vivaflow@(100kDa MWCORC)进行切向流过滤TFF。对于TFF(从中通过超滤膜去除原始溶剂)，使用Vivaflow@有，具有生物医学相关性的较小石墨烯片实际未受到损失。氧化石墨烯的回收率较高，即使未高于传统离心方法，也至少与之相近。在去除污染物及中和pH值方面， Vivaflow@还显著缩短了处理时间。采用此改进方法时，总处理时间和仅仪器运行时间分别节省189.5小时(95%)或59.5小时(85%)。此外，TFF减少了对含有较小片材的大量氧化石墨烯上清液废物进行特殊处理的需求，从而成为一种更具生态性的工艺。此外，因为在使用TFF时可连续实施洗涤工艺，所以通过避免常规离心方法固有的样品操作，可显著减少劳动力。 TFF可显著提高工艺速度而不会对氧化石墨烯产量造成损失，因而可能代表一种在石墨烯大规模生产方面更具商业可行性的理想解决方案。 GO 氧化石墨烯 TFF 切向流过滤 MWCO 截留分子量 2D 二维 PES 聚醚砜 RC 再生纤维素 UV-vis 紫外-可见光 ( 参考文献 ) ( 1. 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