曲妥珠单抗中曲妥珠单抗药物二硫键分析检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-553Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-QTOF-034 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 节生物学活性方面至关重要。二硫键还是影响单克隆抗体药物有效性和安全性的重要因素，也是产品结构表征的关键环节。 本文采用岛津 LCMS-9030 Q-TOF四极杆-飞行时间液质联用仪对曲妥珠单抗非还原酶解后肽段进行分析，并结合岛津LabSolutions 和 Protein Metrics 软件对检测结果进行解析，快速进行二硫键定位。 实验部分 1.1仪器 本实验使用高效液相色谱仪 LC-30AD 与四极杆飞行时间质谱仪 LCMS-9030 联用系统。具体配置为： 具体配置为： 系统控制器：CBM-20Alite 脱气机： DGU-20A， 输液泵： LC-30AD×2 自动进样器：SIL-30AC 柱温温： CTO-20AC 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.96 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-packGISS C18 (150 mm× 2.1 mm l.D.，1.9 um)， PN：227-30048-03，岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-0.1%甲酸乙腈溶液 流速：0.4mL/min 柱温：50℃ 进样体积：2uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为3%，时间程序见表1。 表11梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.00 Pump B.Conc 3 50.00 Pump B.Conc 50 51.00 Pump B.Conc 90 56.00 Pump B.Conc 90 56.10 Pump B.Conc 3 60.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI+加热模块温度：400℃雾化气流速：3.0L/min干燥气流速：10.0L/min加热气流速：10.0L/min扫描模式： MS和 MS/MS (DDA)接口温度：300℃接口电电：4.5kV DL 温度：250℃ 事件时间： 0.1s I样品前处理 使用超纯水将曲妥珠单抗粉末制剂配制成 1.0 mg/mL的溶液，然后吸取10uL 该溶液样品，加入80 uL变性溶液(50 mM Tris-HCl， 含8M尿素)，在37℃下震摇60 min， 结束后加入4 uL IAA溶液(500mM)，在室温条件下避光震摇 30 min， 然后加入 600 uL 酶解缓冲液(50mM Tris-HCI) 和5pL胰蛋白酶溶液(含1ug胰蛋白酶)，在37℃下反应6小时，酶解结束后加入10 uL 50%甲酸水溶液终止酶解反应，然后转入低吸附 PP材质的样品瓶：进行 LC/MS 分析。 结果与讨论 3.1曲妥珠单抗非还原酶解肽段色谱图 图1曲妥珠单抗非还原酶解肽段总离子流色谱图 3.2曲妥珠单抗理论二硫键连接 曲妥珠单抗属于IgG1型的单抗药物，此类抗体主要存在16对二硫键。其中重链内部有8对，轻链内部有4对，轻链和重链链间有2对，重链链间有2对。由于单抗结构的对称性，故非冗余的二硫键共有9对。曲妥珠单抗理论二硫键连接示意图和9对非冗余的二硫键清单见图2. 图21曲妥珠单抗理论二硫键连接示意图(左)和非冗余的9对二硫键清单(右) 3.3 Protein Metrics 结果解析 将 LabSolutions 采集好的数据直接导入到 Protein Metrics 软件的 PMi_S-S模块，并导入曲妥珠单抗的氨基酸序列，即可进行二硫键快速自动解析。曲妥珠单抗 Protein Metrics 二硫键解析结果软件截图见图3，在仅使用胰蛋白酶的条件下，曲妥珠单抗所有9对非冗余的二硫键都得到了鉴定。通定 PMi_S-S模块，还可以进一步查看鉴定到的二硫键连接肽段对应的提取离子流色谱图、一级质谱图和二级质谱图，可对鉴定结果进行确认。重链内二硫键连接 Cys264-Cys324的色谱图和质谱图见图4。 Expected Anti-HER2 Heavy chain (1 and 2) 22 96 147 203 223 214 229，232 229，232 264 324 428 370 Anti-HER2 Light chain (1 and 2) 23 88 134 194 R.LScAASGFNIK.D R.AEDTAVYYCSR.W (：ell) K.STSGGTAALGcLVK.D K.DYFPEPVTVSWNSCALTSCVHTFPAVLQSSCLYSLSSVTTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTK.V (：ell) K.ScDK.T R.GEC.· Anti-HER2Light chain (l and 2) K.THTePPePAPELLGGPSVFLFPPKPK.D K.THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK.D (ell) R.TPEVTeVT7DVSHEDPEVK.F K.CK.V (：ell) R.WQQGNFSeSVMHEALHNHYTQK.S K.NQVSLTCLVK.C (：ell) R.VTITcR.A R.SCTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFCQCTK.V (；ell) K.SGTASVTeLLNNFYPR.E K.VTACEVTHQCLSSPVTK.S (ell) 图33曲妥珠单抗 Protein metrics 二硫键解析结果软件截图 6.000e+55.000e+5 4.000e+5 3.000e+5 2.000e+51.000e+5 0.000e+0 图4 重链内二硫键连接 Cys264-Cys324 的色谱图和质谱图 提取离子流图(上)、、-一级质谱图(中)和二级质谱图(下) |结论 本文基于岛津 LCMS-9030 高分辨 Q-TOF 液质联用仪和 Protein Metrics 数据分析软件，成功鉴定到曲妥珠单抗中所有非冗余的9对二硫键。LCMS-9030 高分辨、高质量数准确度的质谱数据，结合 Protein Metrics 快速、自动的二硫键鉴定流程，助力单抗药物二硫键结构表征，为生物药研发和产品质量保驾护航。 岛津应用云 本文采用岛津LCMS-9030高分辨Q-TOF液质联用仪对曲妥珠单抗进行二硫键分析，并结合岛津LabSolutions和Protein Metrics软件进行结果解析。结果显示，在使用胰蛋白酶的条件下，曲妥珠单抗所有9对非冗余的二硫键都得到了鉴定。使用Protein metrics软件还可对鉴定到的二硫键连接肽段的提取离子流色谱图、一级质谱图和二级质谱图进行查看，对结果进行进一步确认。该方法快速、准确，为单抗药物的二硫键鉴定提供参考。