血清中抗凝血鼠药检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-565Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-560 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn ATLAS-LEXT LCMSMS联用检测血清中10种抗凝血鼠药 LCMSMS-560 摘要：使用岛津全自动样品处理平台 ATLAS-LEXT 联合三重四极杆液质联用仪，建立了血清中10种抗凝血鼠药的分析方法。本方法参考司法鉴定技术规范《SF/Z JD0107018——2018血液中溴敌隆等13种抗凝血类杀鼠药的液相色谱串串质谱检验方法》，样品由ATLAS-LEXT 完成全自动前处理，萃取溶剂为乙酸乙酯。本方法采用外标法定量，化合物线性相关性良好，相关系数在0.995以上。低、中、高三个浓度水平加标回收率及重复性性察结果显示，各组分回收率在77.15~130.09%之间，相对标准偏差在1.38~7.79%之间，方法准确可靠。 关键词： ATLAS-LEXT三重四极杆液质联用仪抗凝血鼠药 抗凝血杀鼠药包括香豆素类和茚满二酮类两种，是目前广泛使用的一类慢性杀鼠药，与急性杀鼠药如毒鼠强相比，该类鼠药具有适口性好、不易被鼠拒食等特点，杀鼠效果显著。由于使用广泛，人、畜中毒的情况时有发生。因此建立抗凝血类鼠药准确、灵敏的测定方法十分必要。 本方法参考司法鉴定技术规范 《SF/ZJD0107018-2018血液中溴敌隆等13种抗凝血类杀鼠药的液相色谱串联质谱检验方法》，利用岛津ATLAS-LEXT完成样品的自动化前处理，并与三重四极杆液质联用仪联用，建立一种简便、快速、准确的抗凝血类鼠药的分析方法，供相关人员参考。 实验部分 1.1仪器 岛津全自动样品处理平台 ATLAS-LEXT和岛津三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。 具体配置为： 输液泵： LC-30AD×2 在线脱气机： DGU-20A5 自动进样器：SIL-30AC 柱温箱： CTO-20AC 系统控制器：CBM-20A 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.97 质谱仪：LCMS-8050 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack Septer C18-120 100 mm×2.1 mm l.D.， 3 um； P/N： 227-31014-05；岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-10mM 乙酸铵水溶液；B相-甲醇 流速：0.4mL/min 柱温：40℃ 进样量：2uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始流动相比例为40%，时间程序见表1 表11梯度洗脱时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 5.00 泵 B.Conc 95 6.00 泵 B.Conc 95 6.10 泵 B.Conc 40 8 控制器 Stop 20.00 80% 20% LCMS-8050 质谱条件： 离子源： ESI(-)接口电压： -3kV雾化气流速：3L/min加热模块温度：400℃加热气流速：10.0L/min扫描模式：多反应监测(MRM)接口温度：350℃干燥气流速：10.0L/min DL温度： 150℃ MRM 参数：见表2 表2MRM优化参数 No. 名称 CAS 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 228.90 116.00* 12 36 10 异杀鼠酮 83-28-3 145.00 12 22 13 2 杀鼠酮 83-26-1 228.90 116.00* 12 35 22 172.10 12 20 15 3 华法林 81-81-2 307.00 161.10* 21 19 16 250.10 11 23 11 4 杀鼠醚 5836-29-3 291.25 141.20* 21 26 13 247.20 14 21 11 5 鼠得克 56073-07-5 443.25 293.30* 16 35 13 135.20 16 35 12 6 氟鼠灵 90035-08-8 541.20 382.20* 20 26 18 161.15 20 36 16 7 溴敌隆 28772-56-7 525.15 250.20* 20 36 11 273.15 20 36 12 8 溴鼠灵 56073-10-0 521.10 135.20* 24 37 13 79.10 36 45 28 9 氯杀鼠灵 81-82-3 341.10 284.10* 23 23 13 161.10 12 20 16 10 敌鼠 82-66-6 339.10 167.05* 12 23 16 145.20 12 23 14 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配置 分别取抗凝血鼠药标准溶液，用甲醇稀释，配制混合工作液，放置于-20℃冰箱中保存。取混合工作液用甲醇分别稀释至 2.5 ng/mL、10 ng/mL 和100 ng/mL， 待分析。 1.4样品前处理方法 在样品管中加入1mL血清，采用ATLAS自定义程序进行液液萃取。萃取流程：向样品管中加入3mL的乙酸乙酯，震荡离心后取2.4 mL 上清液到干净样品管中，再向样品管中加入2.4mL的乙酸乙酯，震荡离心后取2.4 mL 上清液，合并两次提取液，60℃减压浓缩至干。干燥完成后加入 0.2 mL甲醇复溶，0.22 um 滤膜过滤后上机分析。 重复两次 氮吹/真空干 图1 ATLAS-LEXT样品处理流程图 校准曲线和质控样品：取空白血清样品若干份，添加适量目标物，配制系列浓度的添加样品。按上述步骤完成样品前处理，上机分析。 |结果与讨论 2.1专属性 取人空白血清，按照1.4方法和选定的色谱条件处理并测定，得空白血清、1 ng/mL 血清基质加标样品的 MRM色谱图，见图2。结果表明，空白血浆中的内源物质干扰，对样品检测无明显影响，方法具有较强选强性。 图210种抗凝血鼠药标准样品(5ng/mL)和空白血浆 MRM重叠色谱图 2.2线性范围 向空白血清样品中加入适量的标准工作溶液，得到加标浓度分别为 0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0ng/mL、20.0 ng/mL 和 40.0 ng/mL的样品，按照1.4步骤，制备基质匹配校准曲线溶液，上机分析，以各目标物的加标浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，以外标法绘制标准曲线，所得校准曲线线性关系良好，均大于0.995，线性方程及相关系数见表3。 表3校准曲线和检出限 序号 化合物 线性范围(ng/mL) 校准曲线 相关系数 准确度(%) 1 异杀鼠酮 0.5-40.0 v=8985.873-203.8694 0.9987 88.37-109.66 2 杀鼠酮 0.5-40.0 v=14210.305x-398.8101 0.9997 97.49-105.32 3 华法林 0.5-40.0 v=101341.3x--2437.500 0.9999 99.73-102.34 4 杀鼠醚 0.5-40.0 v=44923.91x-1030.584 0.9982 93.15-110.45 5 鼠得克 0.5-40.0 v=62016.83x+2166.622 0.9981 94.59-106.74 6 氟鼠灵 0.5-40.0 v=215144.5x-13345.08 0.9972 90.31-103.81 7 溴敌隆 0.5-40.0 v=43156.82x+2350.558 0.9982 92.90-107.74 8 溴鼠灵 0.5-40.0 v=17275.78x+457.0867 0.9962 91.96-113.82 9 氯杀鼠灵 0.5-40.0 v=86498.53x+2551.694 0.9994 92.10-107.04 10 敌鼠 0.5-40.0 y=156896.5x+12674.99 0.9951 86.18-108.48 2.3灵敏度 根据言噪比计算血清中10种抗凝血鼠药的方法检出限和定量限，检出限(S/N=3)均低于标准要求的0.2 ng/mL，符合标准要求。 序号 化合物 检出限(ng/mL) 定量限(ng/mL) 1 异杀鼠酮 0.094 0.282 2 杀鼠酮 0.116 0.348 3 华法林 0.008 0.024 4 杀鼠醚 0.037 0.111 5 鼠得克 0.053 0.159 6 氟鼠灵 0.002 0.006 7 溴敌隆 0.025 0.077 8 溴鼠灵 0.063 0.189 9 氯杀鼠灵 0.006 0.017 10 敌鼠 0.021 0.062 2.4重复性 按照1.3步骤配制低、中、高浓度标准溶液，连续进样6次，考察该分析方法下待测物峰面积和保留时间的重复性。10种抗凝血鼠药的峰面积 RSD 值均小于7.87%，保留时间 RSD 值均小于0.16%，表明方法重复性良好。 序号 化合物 2.5 ng/mL 10 ng/mL 100 ng/mL 峰面积RSD% 保留时间RSD% 峰面积RSD% 保留时间RSD% 峰面积RSD% 保留时间 RSD% 1 异杀鼠酮 7.87 0.16 3.34 0.15 2.45 0.15 2 杀鼠酮 6.58 0.10 5.86 0.09 2.66 0.14 3 华法林 2.26 0.10 1.32 0.12 1.44 0.15 4 杀鼠醚 5.17 0.06 2.58 0.10 2.27 0.12 5 鼠得克 7.68 0.06 3.13 0.07 2.37 0.09 6 氟鼠灵 1.59 0.05 1.86 0.06 1.26 0.08 7 溴敌隆 5.38 0.07 2.84 0.07 1.28 0.09 8 溴鼠灵 7.53 0.05 1.66 0.05 0.78 0.08 9 氯杀鼠灵 3.53 0.08 1.85 0.10 0.81 0.12 10 敌鼠 3.61 0.10 2.24 0.12 0.93 0.13 2.5加标回收 取空白血清，按照1.4步骤中制备样品和加标样品，低中高3个水平加标浓度如下表5所示，各浓度平行处理6份。测试结果显示：各水平的平均加标回收率在80.68~125.02%之间，相对标准偏差在1.45~10.63%之间。 表5重复性测试(n=6) 序号 化合物 样品浓度 加标浓度 (0.5 ng/mL) 加标浓度(5ng/mL) 加标浓度(20 ng/mL) (ug/L) 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% 1 异杀鼠酮 N.D. 91.13 8.02 80.68 5.48 100.78 4.17 2 杀鼠酮 N.D. 89.03 6.74 92.63 5.39 101.87 1.44 3 华法林 N.D. 98.55 4.35 82.20 5.15 91.19 6.32 4 杀鼠醚 N.D. 95.83 4.50 105.34 2.85 106.69 3.38 5 鼠得克 N.D. 111.40 5.52 104.82 2.82 106.20 2.90 6 氟鼠灵 N.D. 113.33 5.13 114.30 3.79 108.94 5.70 7 溴敌隆 N.D. 99.48 10.63 96.60 2.78 102.85 3.01 8 溴鼠灵 N.D. 125.02 5.51 111.04 2.46 107.45 5.57 9 氯杀鼠灵 N.D. 96.36 7.80 103.93 2.68 103.32 2.30 10 敌鼠 N.D. 105.89 4.59 111.05 2.04 100.02 1.45 注： N.D.表示未检出，低于方法检出限 |结论 本文利用岛津全自动样品处理平台 ATLAS-LEXT完成血清样品的前处理，利用岛津三重四极杆质谱仪完成血清样品上机分析，建立了一种简便、快速、准确的血液中10种抗凝血鼠药的分析方法。本方法采用外标法定量，方法学实验中，各化合物线性相关性好，重复性好，回收率高，方法准确可靠。该方法操作简捷、自动化程度高、分析速度快，供公安理化检测人员参考。 岛津应用云 样品由ATLAS-LEXT完成全自动前处理，萃取溶剂为乙酸乙酯。本方法采用外标法定量，化合物线性相关性良好，相关系数在0.995以上。低、中、高三个浓度水平加标回收率及重复性考察结果显示，各组分回收率在77.15 ~ 130.09%之间，相对标准偏差在1.38~ 7.79%之间，方法准确可靠。