冬虫夏草中气味成分检测方案(气质联用仪)

SSL-CA20-494Excellence in Science Excellence in ScienceGCMSMS-217 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn GCMSMS 法结合气味数据库分析冬虫夏草气味成分 GCMSMS-217 摘要：本文利用岛津GCMS-TQ8050 NX 三重四极杆气质联用仪结合 AOC-6000 自动进样器 SPME Arrow 进 样建立了冬虫夏草中150种气味成分 MRM 定量方法，该方法具有高通量、高灵敏度和准确的特点。基于150种气味成分MRM 方法，对不同产地冬虫夏草中气味成分、冬虫夏草正品和伪品中气味成分进行了研究比较。实验结果表明：典型冬虫夏草中共筛查出了74种气味成分，并对筛查出来的这些气味成分进行了定量。不同产地间的冬虫夏草中气味成分的种类是一致的，仅在含量上存在一定差异，16种化学成分的含量差异比较明显，可作为产地鉴别的标志物进行研究。冬虫夏草正品与伪品之间气味成分存在较大的差异，33种气味成分可作为真伪冬虫夏草鉴别的标志物进行研究。 关键词：：气相色谱-三重四极杆质谱联用仪SPME 冬虫夏草气味成分 中药气味是中药材质量评价的重要内容，有的中药材因其独特的气味特征而成为其质量优劣的评价指标[1]。气味评价是评判中药质量整体性的一种手段，传统的中药材气味评价主要依赖于鉴别者的经验，主观性强，难以客观量化[2]。近几年电子鼻技术开始应用于识别中药材的复杂气味，能在一定程度上数字化、客观化表征中药气味，但是电子鼻技术尚不能高通量、精准地对中药气味的具体组成成分进行定性定量分析，不能进一步阐述中药气味与质量优劣之间的内涵。 冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis (BerK.) Sacc. 寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，是我国传统的名贵滋补药材。目前评价冬虫夏草的质量优劣等级主要通过虫体大小、颜色、气味、、子座长短等指标。冬虫夏草主 实验部分 1.1仪器 GCMS-TQ8050 NX气相色谱-三重四极杆质谱联用仪 AOC-6000 自动样品处理平台 1.2分析条件 SPME Arrow： ARR15-DVB/C-WR-120/20 老化温度：270℃；平衡温度：50℃ 平衡时间： 5min；萃取时间：15min 解吸时间：2min 色谱柱： InertCap Pure-wax， 30 m×0.25mm×0.25 um 柱温程序：50℃(5 min)_10℃/min_250℃(10 min) 要表现出一种“腥味”[3]，但这种“腥味”到底是来自于子座还是虫体， 气味中含有哪些化学成分，其气味浓烈的程度与其质量优劣是否存在关联性等方面尚未见到相关研究报道。 顶空固相微萃取(Head Space-Solid Phase Micro-extraction， HS-SPME)是羊种样品前处理技术，：，它对待测物集提取、富集、解吸和进样等步骤于一身，具有操作简便快速、灵敏度高、环境友好等特点。HS-SPME 技术适合分析易挥发性和半挥发性物质。本研究尝试基于HS-SPME-GC-MS/MS 联用技术建立冬虫夏草气味成分快速分析方法，辨识冬虫夏草“腥味”中的化学成分组成，探讨不同产地之间冬虫夏草的气味差异，以期为冬虫夏草的质量优劣评价提供客观数据支撑。 进样口温度：250C 载气控制方式：恒压控制，83.5KPa 进样方式：分流进样，分流比：5：1 离子源温度：200℃ 接口温度：250℃ 采集模式： MRM/SCAN 样品前处理 9批次冬虫夏草采集于四川、青海、西藏等地区，6批次冬虫夏草伪品采集于贵州和新疆等地，粉碎成细粉(过三号筛)备用，具体采样地点信息见表1，典型的冬虫夏草和伪品见图1。准确称取冬虫夏草粉末0.5g置于20 mL顶空瓶中，压盖密封后上机分析。 表1 冬虫夏草样品采集信息表 样品编号 采集地 基原鉴定 海拔高度(米) 备注 yp01 四川甘孜州理塘县 冬虫夏草 4000 采收期 (二期) yp02 四川甘孜州色达县 冬虫夏草 4400 采收期 (二期) yp03 四川阿坝州壤塘县 冬虫夏草 3600 采收期 (二期) yp04 西藏那曲 冬虫夏草 5500 采收期(头期) yp05 青海玉树州 冬虫夏草 4600 采收期(头期) yp06 青海果洛州雪山乡 冬虫夏草 5400 采收期(头期) yp07 青海果洛州青珍乡 冬虫夏草 4900 采收期(头期) yp08 青海果洛州青珍乡 冬虫夏草 4900 采收期(头期)、全虫体 yp09 青海果洛州青珍乡 冬虫夏草 4900 采收期(头期)、全子座 ypl0 贵州 亚香棒虫草 800 --- ypll 贵州施秉县 亚香棒虫草，白色 800 yp12 四川省邛崃市 古尼虫草 1600 yp13 四川省荷花池药材市场 冬虫夏草伪品 --- yp14 新疆 新疆虫草 1800 yp15 四川凉山州雷波县 凉山虫草 3000 --- 图1 冬虫夏草及其伪品的样品照片 (图片由成都市食品药品检验研究院谭鹏提供) 结果与讨论 3.1气味成分MRM 方法建立 正构烷烃 C9-C30标准溶液(10ug/mL)质量色谱图见图2。 图2 正构烷烃 (C9-C30)质量色谱图 150种气味成分校准曲线校正用内标物质(4-溴氟苯、1，2-二氯苯-d4、-d10)质量色谱图见图3，3种内标信息见表2。 1，2-二氯苯-d4 图3 标准曲线校正用3种内标MRM图 表2 内标物质信息表 序号 名称 保留时间/min 定量离子对 CE 1 4-溴氟苯 10.846 174.0>95.0 15 2 1，2-二氯苯-d4 13.032 150.0 >115.0 15 3 苣-d10 21.014 164.0>162.0 15 气味物质数据库结合正构烷烃数据及内标数据，无需150种气味物质标准品，自动生成150种气味物质的MRM定量方法。 3.2冬虫夏草气味成分 MRM 测试结果 图4 典型冬虫夏草供共品品味成分 MRM图 分析结果显示，典型的冬虫夏草中共计筛查出74种气味成分，按化合物结构可分为12类，包括：酯类、酮类、醛类、烯类、酚类、酸类、醇类、硫醚类、吡嗪类、烃类、含氮杂环类、含氧杂环类等，表明冬虫夏草的“腥味”至少由74种气味成分组成，其表现出来的不是单体气味，而是是复合气味。典型冬虫夏草5号供试品 MRM图见图4，筛查出的部分气味成分 MRM 图见图5，15个冬虫夏草样品气味成分测定结果详见表3。 表3 15个冬虫夏草样品气味筛查与定量分析结果(ng/g) yp01 yp02 yp03 yp04 yp5 yp06 yp07 yp08yyp09 yp10 yp11 yp12 yp13 yp14 yp15 酯类 乙酸乙酯 0.120 0.150 00.237 0.220 0.960 1.154 1.194 1.107 1.349 00.873 甲基丙烯酸 甲酯 0.071 0.0722 0.037 0.082 0.037 丙二醇甲醚 醋酸酯 0.073 0.019 0.023 0.0977 0.039 0.361 0.120 00.392 0.1022 0.069 0.133 00.0900 0.0799 0.093 0.155 乙酸己酯 0.010 0.019 0.0210 0.0011 0.015 0.137 0.057 0.00220.070 水杨酸甲酯 0.032 0.031 0.030 0.027 0.030 0.031 0.030 0.016 0.046 0.007 0.015 0.0110.011 0.013 0.019 丙位辛内酯 0.644 0.079 0.080 0.473 1.128 6.083 2.526 0.416 1.094 0.127 0.207 0.178 0.271 0.167 0.712 酮类 2，3-丁二酮 1.456 1.566 1.579 1.474 1.196 0.823 1.1772 2.441 1.247 0.969 4-甲基-3戊 烯-2-酮 0.016 0.014 0.017 0.016 0.015 0.018 0.020 0.07220.024 0.015 0.057 2-庚酮 0.220 0.129 0.155 0.202 0.30990.011 0.043 0.068 0.075 0.095 仲辛酮 0.425 0.304 0.354 0.453 0.573 1.152 0.627 0.538 0.515 0.082 00.077 0.100 0.082 0.373 2-壬酮 1.147 0.345 0.361 0.469 1.599 0.365 0.820 0.069 0.147 0.095 0.387 2-玻酮 0.615 0.2720.409)9 0.3777 0.414 0.319 0.1100.684 0.014 0.038 0.030 0.031 0.023 0.043 异佛尔酮 0.136 0.120 0.127 0.151 0.127 0.161 0.201)1 0.27220.2255 0.005 0.007 0.008 0.007 甲基壬基 甲酮 4.750 1.198 1.968 0.943 苯乙酮 0.489 0.554 0.558 0.5188 0.436 0.451 0.433 0.270 0.7222 0.762 1.412 1.100 1.436 1.356 2.476 二苯甲酮 0.001 0.019 0.006 00.012 0.001 0.006) 0.004 0.00770.0144- -0.007 -0.001-0.001-0.003-0.002 醛类 正辛醛 16.415 15.112 15.976 15.626 33.616 150.93 43.006 12.207 29.379 4.8679.888 9.727 15.293 8.290 37.595 (E)-2-希烯醛 2.339 2.561 1.843 3.279 4.792 2.820 — 14.528 1.207 60.0750.097 0.061 0.033 0.1920.0250.03200.0310.03000.034壬二烯醛香兰素 0.027 0.038 0.024 0.018 0.0200.01900.019 0.017 0.023 烯类 2-蒎烯 0.4100.2850.466 0.36550.4530.401(0.38900.464 0.136 0.069 0.06330.064 0.069beta-蒎烯 0.724 0.585 0.855 0.646 0.8050.645 0.552 0.004 0.249 0.043 0.0420.031 0.046柠檬烯 3.739 3.981 4.889 4.395 4.569 4.439 4.454 2.270 4.3700.1270.228 0.174 0.236 0.186 0.337苯乙烯 1.317 0.850 2.453 0.928 1.037 0.986 0.878 0.550 0.448 0.078 0.144 0.089 0.131 0.125 0.1730.014 0.017 0.023 0.0070.011 0.013 2-苯基-1-丙烯酚类愈创木酚 0.057 0.0510.0220.051 0.05660.0620.0630.02990.12880.0020.013(0.01110.00880.013 0.038邻甲酚 0.215 0.1070.129 0.273 0.2200.388 0.3420.140 0.6420.103 0.202 00.162 0.2350.151 0.350苯酚 0.307 0.313 0.4390.231 0.308 0.327 0.2800.175 0.349 0.313 0.567 0.27110.354 0.3560.4964-乙基-2-0.0150.0070.005 0.008 0.0120.0110.018 0.006 0.031甲氧基苯酚4-甲基苯酚 0.046 0.028 0.044 0.007 0.0400.065 0.061i10.028 0.061 0.007间甲基苯酚 0.051 0.033 0.060 0.03220.0520.106 0.07200.03220.0420.0160.029C0.026 0.029 0.0694-乙基苯酚 0.0130.005 0.008 0.0090.0080.01500.008 0.030 0.004 0.004 0.0020.0030.003酸类乙酸 58.041 37.410 42.233 63.193 35.51774.839 66.34691.689 52.002 52.722 64.291 60.346 62.149 62.423 73.839丙酸 20.694 12.197 18.609 25.363 17.911 29.424 25.202 23.680 20.670 18.037 22.639 22.01022.63021.430 26.961异丁酸 7.823 2.4575.0608.2399 4.554 8.989 7.567 11.0129.2863.765)66.57955.01995.8615.7578.089丁酸 16.6324.673 11.546 16.166 10.586 13.686 15.08115.22818.7887.86513.245 10.801 12.062 12.178 19.214异戊酸 12.670 2.364 5.96921.03712.16218.920 17.471 15.94815.8667.43315.230 13.016 14.628 13.273 16.031正戊酸 13.899 2.8506.500 16.293 19.886 34.787 25.42310.407 20.532 18.332 28.217 28.086 33.562 25.386 45.958己酸 25.600 2.8315.684 29.57145.003 96.214 62.898 26.886 45.767 43.561 36.705 47.668 59.997 31.866 72.064庚酸 2.116 0.796 1.289 1.49772.103 18.480 6.682 2.708 3.7702.654 1.856 2.255 2.836 1.548 3.555壬酸 0.8620.414 0.448 0.459 0.739 4.249 1.742 1.253 1.883 0.904 0.593 0.663 0.789 0.459 1.776正癸酸 0.5060.4860.47200.438 0.5130.6410.442C0.35220.6120.364 0.469 0.41770.409 0.374 0.411醇类桉叶油醇 2.261 1.056 2.339 0.886 1.397 0.889 0.984 1.318 0.5042-乙基己醇 0.020 0.067 0.064 0.094 0.172C0.093 4.329 4.505 8.067 9.044 8.916 8.88850.5772-壬基醇 0.127 0.12220.113 0.147 0.187 0.025 0.064芳樟醇 1.7922.495 2.920 1.137 1.150 1.392 1.337 0.763 2.258 0.136 0.393 0.254 0.195 0.304 0.785正辛醇 0.679 0.761 0.434 0.379 1.452 7.043 2.138 0.921 3.068 0.217 0.505 0.578 0.8000.448 2.234薄荷脑 9.302 11.273 10.409 5.045 8.286 3.960 1.784 1.090 6.9100.173 0.170 0.1300.138 0.216马鞭烯醇 0.078 2.788 0.779 0.105 0.0750.294 0.095 0.138a-松油醇 0.173 0.1910.1420.10770.144 0.1050.12200.506 0.31990.0110.0180.127700.1250.0150.0560.628 1.0150.546 1.0050.039 0.0460.040 0.0700.050 0.0530.058 0.089 2-茨醇 1.414 2.0580.016 香叶醇 0.094 0.103 0.091 0.069 0.066 0.036 0.037 0.220 0.045C0.038 0.059 0.040 苯甲醇 0.387 0.698 0.549 0.77110.671 1.009 0.879 0.403 1.88220.108 0.2000.139 0.136 0.145 0.303 苯乙醇 0.3830.2680.22200.42770.4660.353 0.4680.178 1.981 0.084 0.124 0.089 0.0660.096 0.154 硫醚类 二甲基0.0230.0090.0770.0250.0090.0090.0170.0360.009 - 0.013二硫醚二甲基0.0190.0150.0580.0210.0170.0160.0180.0800.013三硫醚乙二醇0.4340.6350.570 0.3860.3590.4030.2050.87830.035 0.0680.06440.061单丁醚乙二醇苯醚 0.0370.0190.0260.0270.0240.0260.0260.0260.1010.0240.0330.0270.0290.0270.037 吡嗪类 2-甲基吡嗪 1.116 1.0231.1351.0940.9290.8651.0290.888 3.025)0.2260.5200.3080.5810.3822.2642-乙基吡嗪 0.020 0.0160.0140.0280.0160.0670.0200.019 0.0440.0070.0190.0150.0300.0150.0392-甲氧基-3-0.0270.046 0.0310.009 0.0120.009 0.021 — 0.039异丁基吡嗪 烃类萘 0.2940.2880.3290.2270.2290.2250.2430.1530.3410.0270.054 0.0390.0460.044(0.0762-甲基萘 0.2340.3550.1930.1130.1760.1160.1470.0780.275 0.0140.007 0.0100.0181-甲基萘 0.0810.1330.0790.0520.0600.0500.0600.0450.112 0.015含氮杂环类 5-乙基-2-0.0010.0070.004 0.0010.0070.0010.0070.002甲基-吡啶苯并噻唑 0.0490.0440.0490.0460.0360.0370.0380.0260.0660.0180.0270.0210.0210.0200.027己内酰胺 0.697 0.4560.7240.5520.4840.5690.5560.856 1.6280.4590.527 0.5170.5470.5090.556含氧杂环类 丙位癸内酯0.0110.0060.0010.0060.0040.0150.018 — 0.036 — 注： “-”表示未检出。 图5 冬虫夏草中气味成分(部分)MRM图 3.3冬虫夏草质量优劣与气味组成相关性分析 就外观性状比较而言，产自西藏(那曲)和青海(玉树、果洛)的冬虫夏草虫体更大更饱满，颜色金黄，子座较短；而产自四川的冬虫夏草虫体偏小偏偏，颜色偏黑，子座较长，因此传统经验认为前2者的质量优于后者的质量。但值得关注是这种传统经验判别的合理性是否能在气味成分的质和量上得到体现。 分析结果显示，不同产地的冬虫夏草中74种气味成分的含量存在一定差异。为了更直观的呈现含量差异，将产自西藏和青海的冬虫夏草 (yp04、yp05、yp06)归为Ⅰ类，将产自四川的冬虫夏草 (yp01、yp02、yp03)归为Ⅱ类，分别计算每个化合物在Ⅰ类和Ⅱ类冬虫夏草中含量总和；1类中每个化合物含量除以Ⅱ类中每个化合物含量得到含量倍数，发现产自西藏和青海地区的冬虫夏草中74种气味成分的含量普遍高于产自四川地区的冬虫夏草中74种气味成分的含量，以含量倍数差异大于2倍计，筛选出含量差异较大的气味成分有16个[包括丙位辛内酯，正庚酸，正己酸，正辛醇，丙二醇甲醚乙酸酯，正辛醛，正壬酸，乙酸己酯，正戊酸， (E，E)-2，4-壬二烯醛， (E)-壬烯醛，异戊酸，正癸醛，2-乙基吡嗪， (E)-2-庚烯醛，2-辛酮；差异倍数依次为9.57，5.26，5.01，4.74，4.32，4.21，3.16，3.06，3.05，2.63，2.56，2.48，2.35，2.22，2.02，2.01]，这些化合物可能可以作为区分西藏、青海与四川产冬虫夏草的产地特征气味成分，详见图6。 图6 可以作为区分西藏、青海与四川产冬虫夏草产地的16种特征气味成分分布图 实验结果表明，不同产地的冬虫夏草在气味成分种类上没有太大的差异，这提示了产自于西藏(那曲)、青海(玉树、果洛)和四川(理塘、壤塘、色达)的冬虫夏草中气味成分具有一致性，即组成“腥味”的化学成分没有质(种类)的差异。但是不同产区的冬虫夏草中部分气味成分的含量存在较大差异，即组成“腥味”的化学成分有量(含量)的差异。 3.4冬虫夏草虫体与子座“腥气”组成成分差异分析 比较冬虫夏草全虫体(yp08) 和全子座 (yp09)，分析结果显示，在虫体中检测到的气味成分均能够在子座里面检测到，仅存在含量差异。相反，在子座中能被检测到而在虫体中没有被检测到的气味成分有(E)-2-庚烯醛、反式-2-壬醛、反式-2-癸烯醛、2-羟基苯甲醛、2-苯基-1-丙烯、2-壬基醇、马鞭烯醇、丙位癸内酯等，提示这些化合物可能主要由子座产生。 3.5冬虫夏草正品与伪品：“腥气”组成差异分析 冬虫夏草正品(yp01~yp07)和伪品(yp10~yp15)的分析结果显示，在正品中含量显著低于伪品中含量的气味成分有3个，而在正品中含量显著高于伪品中含量的气味成分有30个，详细见表3。上述分析结果表明，冬虫夏草正品和伪品之间气味成分存在较大的差异。 表4 冬虫夏草正品和伪品之间气味成分比较 正品含量显著高于伪品含量的气味成分 伪品含量显著高于正品含量的气味成分 乙酸己酯* 正辛醛 2，3-丁二酮 苯甲醛 仲辛酮 苯乙醛 2-壬酮 香兰素 2-茨酮 2-蒎烯 异佛尔酮 beta-蒎烯 甲基壬基甲酮* 柠檬烯 乙酸乙酯 2-苯基-1-丙烯* 苯乙烯 芝苯乙酮 4-乙基-2-甲氧基苯酚* 4-甲基苯酚 2-乙基己醇 芳樟醇 桉叶油醇* 薄荷脑 乙二醇单丁醚 马鞭烯醇* 2-甲基吡嗪 2-茨醇 2-甲基萘 二甲基二硫醚* 1-甲基萘* 二甲基三硫醚* 丙位癸内酯* 注：*代表仅在冬虫夏草正品中检测到该气味成分 结论 本文基于HS-SPME-GC -MS/MS 技术建立了冬虫夏草中150种气味成分快速筛查和定量分析方法，本方法具有高通量、高灵敏度和准确的特点。实验中使用 SPME Arrow 进样模式对不同产地的冬虫夏草中气味成分、冬虫夏草正品和伪品中气味成分进行分析比较。根据实验结果，典型的冬虫夏草中筛查出了74种气味成分，并对筛查出来的这些气味成分进行了定量分析。 分析结果初步表明，.不同产地之间的冬虫夏草中气味成分的种类是一致的，仅在含量上存在一定差异。本实验筛选出16种气味成分在不同产地之间的冬虫夏草中存在明显的含量差异，可作为浐地鉴别的标志物进行研究。另外，冬虫夏草正品与伪品之间气味成分存在较大的差异，本实验筛选出33种气味成分，可作为冬虫夏草真伪鉴别的标志物进行研究。 ( <参考文献> ) ( [1]陈晓旭，徐茂玲. “ 形 、 色 、 气、 味 ”鉴 中 药[J] . 天津中医药大学学报，2014，33(03)：132. ) ( [2]许舜军，杨柳，谢培山，等.中药气味鉴别的研究现状与展望[J].中药新药与临床药理，2011，22(02)：228. ) ( [ 3]中国玉典.一部 [ S]. 2 015：115. ) 岛津应用云 本文基于HS-SPME-GC   -MS/MS技术建立了冬虫夏草中150种气味成分快速筛查和定量分析方法，本方法具有高通量、高灵敏度和准确的特点。实验中使用SPME   Arrow进样模式对不同产地的冬虫夏草中气味成分、冬虫夏草正品和伪品中气味成分进行分析比较。根据实验结果，典型的冬虫夏草中筛查出了74种气味成分，并对筛查出来的这些气味成分进行了定量分析。     分析结果初步表明，不同产地之间的冬虫夏草中气味成分的种类是一致的，仅在含量上存在一定差异。本实验筛选出16种气味成分在不同产地之间的冬虫夏草中存在明显的含量差异，可作为产地鉴别的标志物进行研究。另外，冬虫夏草正品与伪品之间气味成分存在较大的差异，本实验筛选出33种气味成分，可作为冬虫夏草真伪鉴别的标志物进行研究。