血清中病毒检测方案(大分子作用仪)

SARTORIUS 生物层干涉技术应用文集 Bio-LayerInterferometry (BLI) Application Booklet ForteBio 自成立以来，一直致力于非标记实时分析技术的研发，拥有专利的生物层干涉技术(BLI)，专业提供国际领先的生物分子相互作用分析仪及配套使用的耗材和试剂。目前 ForteBio 已经成为市场上高通量、操作简便、低成本使用以及零维护的非标记实时分析技术品牌。 Octet 分子相互作用技术平台包括仪器、生物传感器和相应试剂盒，是一种无标记的、实时监测的先进技术，主要用于生物分子间相互作用动力学参数以及蛋白浓度的测定。该平台通过浸入即读的检测方式 (Dip and ReadM)来提高检测通量，简单易学并有利于优化操作流程，使得用户能在数分钟内就可以获得大量的可靠数据。在很多应用领域中，这种技术平台可以有效地替代 ELISA、HPLC 以及 SPR技术等分析方法。 生物分子间的相互作用是所有生命现象发生的基础，研究其相互作用可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。2016年，国家自然科学基金“十三五”发展规划正式发布，明确了生命科学部的优先发展领域，第一部分即为：生物大分子的修饰、相互作用与活性调控，主要研究方向包括：生物大分子修饰、动态变化及其功能；生物大分子相互作用的动态性和网络特征；生物大分子特异相互作用的结构基础和预测等。生物分子包括核酸、蛋白、肽类、脂类、小分子、天然产物提取物、病毒等等，而研究这些生物分子的相互作用并了解它们的作用机制和功能机理是当前生命科学研究的热点。 分子相互作用测定仪采用生物层干涉技术，是当今世界上先进的生物分子检测仪器之一。它基于生物层干涉原理，通过监测生物传感器表面的生物分子结合所带来的膜层厚度变化来检测分子间的相互作用的动力学变化或浓度数据。该系统在科研领域的应用非常广泛：1、蛋白质相互作用全面分析：在蛋白质组学中研究蛋白的功能，信号传导研究信号的通路等；2、肿瘤机制研究：直接对临床标本、组织，细胞匀浆等复杂标本进行分析，对肿瘤标记物进行筛选鉴定；3、小分子药物及中药天然产物提取物的筛选和鉴定：快速、准确的筛选与靶蛋白相互作用的小分子药物；44、抗体的筛选：应用于抗体库中抗体的筛选或是多克隆抗体的表位配对，尤其是针对那些低亲和力或是解离非常快的抗体；5、DNA/RNA等核酸与蛋白的相互作用分析：基因调控、转录机制研究；6、病毒颗粒与蛋白的相互作用等。 目录 CONTENTS 生物层干涉技术 (Bio-Layer Interferometry)原理介绍· BLI动力学实验流程· .5 BLI定量实验流程·.. ·5 BLI技术应用展示·· ···6 3.1信号转导研究·.. ·6 3.2结构功能研究·.. ·8 3.3致病机理研究·.. 3.4结构功能研究…· 3.5酶切活性研究… ··11 3.6蛋白复合物研究·.. ·.12 3.7致病机理研究·.. ··13 3.8膜蛋白研究… ··14 3.9垂钓未知分子·· ··15 3.10 DNA-蛋白相互作用研究· ··16 3.11 RNA-蛋白相互作用研究·.. ·.17 3.12核酸适配体(Aptamer) 研究· ··18 3.13小分子化合物筛选….. .19 3.14先导化合物的验证和表征·.. ·20 3.15天然产物/中药的研究·.. ··22 3.16G蛋白活性调控研究· ··24 3.17低氧应答研究·.. ·25 3.18细菌感染机制研究· ··26 3.19抗病毒活性分析·.. ·27 3.20耐药性研究· ··28 3.21流感病毒研究….. ··29 3.22埃博拉病毒研究·.. ··30 3.23细菌与抗体互作… ··.31 3.24细胞与分子互作· ··32 3.25定量检测方法·.. ··33 3.26纳米材料· ...34 3.27表面化学研究· ·35 ForteBio仪器型号…· ··36 4.1超高通量系统- Octet HTX·· ...36 4.2高通量药物筛选系统- Octet RED384.. ..·36 4.3非标记蛋白分析的引领者-Octet RED96e· ..·36 4.4科研工作者的利器- Octet K2· ··37 4.5浓度定量专家-Octet Qke. 4.6灵活轻便的非标记分子互作分析系统- Blitz· ...37 生物传感器选择指南··· ···38 5.1通用传感器... ...38 5.2抗体传感器· ....39 5.3标签融合蛋白类传感器… ...41 5.4 DIP and READTM 检测试剂盒… ·42 生物层干涉(BLI) 是一种非标记技术，它将发生在 BLI生物传感器表面的光干涉信号转化为实时的响应信号。通过对分子结合过程的实时监测，系统会测定结合常数(ka 或kon) 和解离常数 (kd或 koff)，以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力(KD)和浓度信息。 ForteBio 生物传感器由玻璃光纤制成，并在玻璃光纤的末端外加了特殊的光学层。该光学层为配体的固定提 供了表面化学基质(Figure1)。白光(包括可见光谱中的所有波长)被引入玻璃光纤中，并在顶端的两个界面处产生部分内部反射：(1)玻璃光纤 和光学层之间(恒定)的界面；(2)表面化学和溶液(可变)接触的界面 (Figure 2A) 。这两个界面产生的两路反射 光会引发光干涉现象((Figure 2B)，仪器会对每个波长的干涉光强度予以测量记录，并生成干涉光谱曲线(Figure2C)。经历相长干涉的波长在光谱曲线上显示为高振幅，而经历相消干涉的波长则显示为低振幅。Octet 相互作用分析仪就是通过实时测量干涉光谱曲线的变化，以实现检测分子间相互作用的目的。 当分子与固定在生物传感器表面上的配体结合时，引起光学层的厚度增加，第二路反射光的路径长度比之前更长 (Figure 2D) 。这导致干涉光谱曲线发生改变，并向右产生位移。当分子和配体解离时，分子会从生物传感器表面解离到溶液中，这将导致干涉光谱曲线向左移动。以干涉光谱曲线的偏移距离(以nm为单位)与反应发生时间绘制的关系图被称为传感图 (Sensorgram)。通过传感图，可在各种结合模型的基础上拟合出 ka， kd 和KD (Figure3) 的数值。 BLI定量实验流程 BLI技术可用于定量分子的浓度，例如IgG、Fc-融合蛋白、人Fab、含HIS标签或 GST-融合重组蛋白。应用 Octet或 BLItz 系统，生物传感器可在几分钟内确定纯化后或粗制样品中特定分析物的浓度。日由分析物与生物传感器结合产生的结合曲线，其结合速率与分析物浓度是有相关 BLI动力学实验流程 Figure 4 展示了在 Octet 仪器上测定结合动力学的标准流程。ForteBio 的生物传感器提供多种化学界面，无需修饰即可快速轻松地固定配体。动力学传感器均可再生和重复使用，以进一步降低生物传感器的消耗和使用成本。在多通道、高通量 Octet 系统中，，可以同时平行检测多对结合反应，缩短实验运行时间，例如文库筛选，表位分类，实验条件优化，浓度梯度依赖性结合分析等。 性的(Figure 5) 。目前 ForteBio 有针对检测 Protein A、HCP 残留以及唾液酸含量的商业试剂盒。用户也可以在Octet 系统上轻松开发自己所需的高灵敏度定量分析方法。 BLI技术应用展示 3.1信号转导研究 磷酸化和线性泛素决定了A20蛋白的炎症抑制作用 Ingrid E. Wertz， Genetech 公司，肿瘤研究中心 关键词：炎症疾病，A20蛋白，泛素，TNF 信号通路 蛋白与蛋白Nature 自身免疫性综合征和炎症疾病与编码A20蛋白的 TNFAIP3 基因的失活密切相关。作为一种泛素连接酶， A20 蛋白 ZnF 基序结合泛素并促进底物泛素化的功能是目前研究的热点。作者选择了ZnF 中三个代表性的结构域来研究：a.几乎不与泛素结合的 ZnF1； b.确定与K63-泛素三聚体结合的ZnF4，并将其进行结构稳定性突变 (C624AC627A) 和泛素结合突变 (Y614A，Y615A)； c.NMR数据显示可以结合线性泛素三聚体的 ZnF7 及其突变蛋白(F770AG771A)。 作者将生物素化的ZnF1、ZnF4及其突变体、ZnF7及其突变体连接到 SA传感器上，分别与K63连接的泛素三聚体、线性泛素三聚体及 K48 连接的泛素三聚体结合。 结果如上图平衡结合曲线所示：A20蛋白中的ZnF4区域主要与 K63 连接的泛素三聚体反应，而ZnF7区域主要与线性泛素三聚体反应，无论ZnF1、ZnF4、ZnF7均不与 K48 连接的泛素三聚体反应。具体亲和力常数(KD)见下表： A20 ZnF A20 residues Kp (uM) human murine mono-Ub tri-Ub K63 tri-Ub linear tri-Ub K48 ZnF4 WT WT 230±20 1.7±0.1 >50 N/D ZnF4 C624A. C627A C609A. C612A N/D N/D N/D N/D ZnF4 site 1l629R 90±30 ZnF4 site II Y614A， F615A Y599A， F600A N/D N/D N/D N/D ZnF4 site III K606E 110±30 ZnF4 site l+III I629R， K606E 50±13 ZnF7 WT 110±40 N/D 0.004±0.002* N/D ZnF7 F770A.G771A N/D N/D N/D N/D ZnF1 WT N/D N/D N/D N/D *Value is for Ko strong； Ko weak=0.5±0.1 pM 这说明结构的稳定性是 ZnF 与泛素三聚体结合的前提条件，任何影响结构稳定性及结合稳定性的改变均使其失去泛素连接酶的活性。同时 ZnF4 与 ZnF7 与泛素三聚体 的结合不同，因此在一定条件下共同调节A20 蛋白的功能。BLI 技术非常直接地证明了 A20 蛋白在泛素连接酶的功能中起着决定性的地位。 ( 参 考 文献 ) ( Ingrid， Wertz. et al. Phosph o ry l ation and linear ubiquitin direct A 2 0 inhibition ofinflammation.Nature， 538， 370-397 (201 5 ) ) 信号转导研究(蛋白-多肽) RALF4/19 肽与 LRX 蛋白粗提物的相互作用以控制拟南芥中的花粉管生长 M. A. Mecchia，苏黎世大学，苏黎世-巴塞尔植物科学中心 关键词：拟南芥， RALF4/19多肽，LRX蛋白，细胞生长 蛋白与多肽Science 细胞外基质变化与细胞内部的交流对于细胞的功能至关重要。 RALF 家族的胞外肽被认为是CrRLK1L 亚类的受体样激酶的配体，但其确切的机制尚不清楚。本文研究发现拟南芥 RALF4 和 RALF19 可以调节花粉管的完整性和生长情况，其功能依赖于花粉中的 LRX 家族蛋白。 LRX 蛋白与 RALF 相互作用，并监测细胞壁的生长变化，通过 CrRLK1L 途径传递到花粉管内部维持正常生长。 Complex of RALF anti-GFP：LRX8(crude) 如上图所示，作者首先将 GFP 抗体加入到融合GFP 的 LRX8的粗提物形成抗体受体复合物，然后用 proA 传感器固化抗体受体复合物，与不同浓度多肽进行相互作用。 果非常接近 技术可以直接固化粗样品检测多肽，并且可以获得良好的重复性(如图)。 BLI检测 LRX8与 RALF 多肽的原始数据 实时动力学曲线见上图，通过软件分析得到 KD=0.9uM。说明LRX8与 RALF 多肽直接结合。本文采用 proA 传感器抓取 GFP抗体与 GFP 融合蛋白的复合物来实现检测，说明BLI技术可以直接固化粗样品检测多肽，并且可以获得良好的重复性。 ( 参考文献 ) Martin， Mecchia， et al. RALF4/19 peptides interact with LRX proteinsto control pollen tube growth in Arabidopsis. Science， 358(6370)：1600(2017) 3.2结构功能研究 难梭菌毒素B靶向结肠上皮细胞的 Frizzled 蛋白 Min Dong， 加州大学，生理学与生物物理学系 关键词：艰难梭菌，毒素B， Wnt受体， Frizzled 蛋白 >蛋白与蛋白Science 艰难梭菌 (Clostridium difficile， C.diff) 感染是发达国家中抗生素相关性腹泻最常见的病因。其主要毒力因子艰难梭菌毒素B(TcdB) 通过与 Wnt 受体的 FZD 蛋白家族的结合而靶向在结肠上皮。文章作者找到了与人 FZD2的半胱氨酸富集域 (CRD2) 结合的 TcdB 片段 (1285~1804残基)，即TcdB-FBD。作者通过 BLI 技术， 将 Fc-CRD2 结合在AHC 传感器上，与不同浓度的全长 TcdB以及 TcdB-FBD的不同突变体检测发现，蛋白质-蛋白质相互作用界面相关的突变 (D1501A、Y1509A/N1511A和Y1509A/Q1599A) 大大削弱了 TCDB-FBD-CRD2 的结合。 野生型的亲和力是这些突变的43到138倍。 综合上述结果及其他实验，文章揭示了内源性的 FZD结合的脂肪酸是 TcdB 结合的共受体。TcdB 结合 FZDs后会将脂质锁定在适当的位置，从而阻断Wnt 信号通路。通过该研究，最终作者确立了脂肪酸在 FZD 介导的 TcdB 发病机制中的中心作用，并提出利用TcdB 对 FZD的拮抗机制将毒素作为靶点用于治疗应用的潜在可能性。OCTET 不仅可以用于点突变亲和力的检测，而且可以检测多个蛋白相互作用的关系。 ( 参考文 献 ) ( P e ng， Chen. e t a l . S truc t u r al basis for rec o gnition o f frizzled proteins by Clostridium difficile toxin B . Science， 36 0 ， 6 6 4- 6 69 (20 1 8 ) ) 艰难梭菌毒素B靶向结肠上皮细胞的 Frizzled 蛋白 Liang Tao， Min Dong， 波士顿儿童医院&哈佛医学院，泌尿外科&微生物学和免疫生物学系 关键词：艰难梭菌，毒素B， Wnt受体， Frizzled 蛋白 艰难梭菌 (Clostridium difficile， C. diff) 是“远近闻名”的紧急耐药胃肠道感染威胁，是抗生素相关腹泻和胃肠炎死亡最常见的病因。它对多种抗生素不敏感，而且服用抗生素会打破肠内菌群的平衡，导致艰难梭菌累积并产生大量的细胞毒素B(TcdB)，破坏肠内细胞。 本文利用 CRISPR/Cas9 技术发现，敲除了 FZD1/2/7基因的细胞对 TcdB 具有很强的耐受性，敲除了 FZD7的小鼠也可以抵抗 TcdB 的破坏。从而鉴定出 Frizzled 家族为 TcdB 的结合靶点。为了进一步在分子水平验证两者的结合，作者将 Fc-FZD 固定在 AHC 传感器上与 TcdB 毒素进行结合动力学分析，如下图所示： 结果显示，TcdB与 FZD1/2/5/7受体的 CRD 结构域均明显结合，其中FZD1/2/7结合较强 (32nM/19nM/21nM)， 而 FZD5的结合相对偏弱(670nM)。说明部分 Frizzled家族蛋白成员可能是做为 TcdB 的低亲和力受体。 ( 参 考 文献 ) ( Liang， T ao. e t al. Friz z led are colon i c epithelial receptors for Clos t ridium difficile t oxin B . Nature， 538 ( 76 2 5)， 3 5 0 - 355 (2016 ) ) 3.4结构功能研究 跨核膜复合物 SUN-KASH结构分析 周兆才，中科院上海生化细胞所，细胞生物学国家重点实验室 关键词：跨膜复合物， SUN， KASH，晶体结构 蛋白与多肽Cell Research 核骨架和细胞骨架(LINC)复合物的连接体由SUN 和KASH 结构域组成，并桥接核膜的内膜和外膜。LINC 复合物在细胞核定位，细胞极化和细胞僵硬中起关键的作用。本文作者研究确定了人类的SUN-KASH 复合物的晶体结构，并对其复杂的结构进行了深入分析，发现 SUN结构域同源三聚体结合三个独立的“钩”样 KASH 多肽。 为了研究不同氨基酸位点在复合物形成中的作用，作者使用BLI技术，通过 SA 传感器固定生物素化的 KASH 和不同的SUN (野生型和突变体)进行结合实验。结果如上图所示，野生型的 SUN 与 KASH 具有最强的结合。除去 AA’ loop 的 SUN 突变体不再结合 KASH。而对 SUN结合位点区域疏水口袋的保守氨基酸位点进行突变分析发现， G609D 单点以及 A603E/S641E/Y703E 三点突变后均极大地破坏 SUN-KASH 的结合。而 Y703E 单点突变则并未明显影响结合信号。说明 G609D/A603E/S641E 这些位点和AA’loop对于两个结构域的结合时必不可少的。 Nucleoskeleton 另外，作者发现SUN 结构域连接的两个基序 (CC1和CC2)对SUN-KASH 复合物的结合具有调控功能。CC1直接结合核内膜，通过 CC2 再与 SUN 结构域结合。利用BLI技术检测如右上图所示， SUN可以直接与 KASH 结合，CC2-SUN则极大减弱了该结合，而 CC1-CC2-SUN则是加强了这种结合。说明 CC1基序具有激活作用，而 CC2则是起到抑制作用。 ( 参 考文献 ) ( Wenjia， Wang. et al. Structural insights into SUN-KASH comp l exes across th e nuclea r envelop e . Cell R esearch， 22，1440-145 2 (2012) ) 胰蛋白酶切割位点突变的 Exendin 4-Cysteine1 ——一种口服生物利用的胰高血糖素素肽-1受体激动剂的系统设计 Wenbo Sai， 高向东，姚文兵 蛋白与蛋白Int.J.Mol.Sci 中国药科大学，生命科学与技术学院，江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室 关键词：Exendin 4， Cysteinel，口服，TSME-1，ⅡI型糖尿病 Exendin-4 是治疗代谢综合征的强效治疗候选物，其相关的受体激动剂药物自2005年就开始上市销售。但是，技术缺陷和皮下注射引起的疼痛严重影响了患者的体验。 作者发现 C57BL/6J小鼠口服 Exendin4-Cysteine 具有明显的降血糖作用。文章通过筛选得到了胰蛋白酶切割位点突变的 Exendin4-Cysteinel(TSME-1)，几乎完全抗胰蛋白酶，还可以明显地将血糖水平正常化，并且TSME-1 的可用性显著高于 Exendin-4 和 Exendin4-Cysteine。因此，口服型 TSME-1是未来治疗Ⅱ型糖尿病的强有力候选者。 在本研究中BLI技术起到了决定性的作用。如上图所示，作者将 Exendin-4 固定在 SA传感器上，然后与小肠分泌的不同蛋白酶(Trypsin/Chymotrypsin/Elastinase/CPA/CPB)进行结合实验，发现 Trypsin的酶切效率最高。这 与 HPLC的筛选结果完全一致。然后作者选择 Trypsin 作为主要的酶进行分析，并确定了特异性的酶切位点，并以此进行突变进行后续试验。 参考文献 Wenbo， Sai. et al. Systematic Design of Trypsin Cleavage Site Mutated Exendin4-Cysteine 1， an Orally Bioavailable Glucagon-Like Peptide-1ReceptorAgonist. Int. J. Mol.Sci.， 18，578(2017) 3.6蛋白复合物研究 蛋白辅助分子伴侣招募 BiP 到单体化 IRE1并抑制未折叠蛋白质反应 Niko，Wetzel，剑桥大学，剑桥医学研究所 关键词：内质网应激(ER)，未折叠蛋白反应(UPR))， IRE1， Complex 当未折叠蛋白质在内质网(ER)中积累时，未折叠蛋白质反应 (UPR)可以增强ER-蛋白质折叠能力以恢复蛋白质折叠稳态。未折叠蛋白质通过促进 IRE1(一种保守的跨膜受体)的寡聚化作用将穿过 ER 膜的 UPR信号激活至细胞核。 本文研究表明，ER辅助分子伴侣 ERdj4 能够与 IRE1结合并通过 ATP 水解的刺激招募 BiP 形成复合物，并强行破坏IRE1二聚体，抑制IRE1的二聚进而抑制UPR的激活。这个复合物通过核苷酸交换而解离， ERdj4 和 BiP会重新招募单体或二聚的IER1， 再次开始抑制UPR 激活的循坏。作者利用 BLI 技术展示了整个复合物的形成过程，如上图所示，IRE1 固定在SA 传感器上，先结合不同浓度的ERdj4，，1在 Buffer 中不解离，结合很牢固。当转移到 BIP+ATP的环境中时，先出现明显的结合信号，然后很快发生解离。说明 BiP 将 ERdj4 竞争下来，与IRE1结合并促使其解聚成单体。 此外，作者将 IRE1， ERdj4 和 BiP 的突变体以及 +/-ATP有无的情况做了多组对照，从而验证以上复合物的特异性反应过程，即 IRE1-ERdj4-BiP+ATP。 在IER1/ERdj4复合物形成后，无法与不含有ATP的或者突变的 Bip结合(招募)，只与含有 ATP的野生型的 Bip结合，并促使IRE 解聚 整个文章大量采用BLI 技术，动态分析蛋白复合物形成过程，描绘了未折叠蛋白反应的信号调控机制。 ( 参 考 文献 ) ( Niko， Wetzel. et al . A J-Pro t ei n Co-cha pe rone R ec ruits BiP toM on omerize IRE1 and R epr e ss the Unfolded Protein Respo ns e. C e ll，171， 1 625- 1 637 (2017 ) ) Shigella 效应器泛素化和降解 GBP 以抑制宿主防御 李鹏，邵峰，北京生命科学研究所(NIBS) 关键词：志贺氏痢疾杆菌，GBP(鸟苷酸结合蛋白)，宿主防御 蛋白与蛋白Nature 干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白 (GBP)能够介导细胞自身的抗菌防御。志贺氏杆菌中编码一种分泌型系统效应蛋白侵入质粒抗原 Hs (lpaHs)。IpaH 代表着细菌泛素连接酶的一个大家族，它们的功能还不清楚。 最终文章揭示了志贺氏痢疾杆菌效应蛋白 lpaH9.8通过泛素化降解宿主细胞内被干扰素调节的 GBPs，从而抑制宿主的免疫反应并促进病原菌在宿主内的生存和增 作者利用转座子筛选鉴定了志贺氏菌 IpaH9.8的突变可以防止hGBP1的降解。通过 BLI技术，将lpaH9.8固定在 SA传感器上，与不同浓度的 hGBP1进行动力学检测，发现两个蛋白具有明显的结合(如左图所示)。以此证明了 hGBP1 为 IpaH9.8 的受体。 当lpaH9.8不存在或者在 hGBP 与 IpaH9.8的结合被干扰时， hGBP1转位到志贺氏菌的胞内，可以抑制细菌复制。为了验证这种突变的影响，作者将hGBP1固定在 SA 传感器上，与野生型和突变体的 IpaH9.8进行结合，发现突变体完全不能结合hGBP1(如左图所示)。同时动物实验表明，当被 IpaH9.8基因缺失的志贺氏菌感染后，小鼠可以存活，而野生型志贺氏菌感染后的小鼠则死亡。结果完全一致。 殖。IpaH9.8的活性充分说明了 GBPs 在抗菌防御中的重要作用。 3.8膜蛋白研究 构象生物传感器揭示来自内体的 GPCR 信号传导 蛋白与蛋白 RoshanakIrannejad， Mark von Zastrow， 加州大学，细胞与分子药理学系 关键词：生物传感器， GPCR，信号传导 Nature 一般认为G蛋白偶联受体 (GPCR)与异源三聚G蛋白偶联介导的典型信号转导仅限于质膜。后来有人提出通过内化的 GPCRs 的信号传导受到G蛋白依赖机制的限制。例如 arrestins 的支架化，或者 GPCR 激活引发持续的G蛋白的信号形式，或者内化的 GPCR 确实可以促进急性G蛋白介导的反应。但是支持这些假设的证据都是间接的或只是替代性解释，并且内体 GPCR 的活性形式是否存在还不清楚。 本研究使用构象特异性抗体(纳米抗体) Nb80直接检测哺乳动物活细胞中的原型GPCR——B2-adrenoceptor(B2-AR)及其同源G蛋白Gs的激活。结果显示，异丙肾上腺素能够促进受体和G蛋白在质膜中的活化，而且在早期内体膜中也是如此，内化的受体在激动剂作用后数分钟内就可以促成整体细胞环 AMP反应。这些发现直接证明了典型 GPCR 信号同时存在于内体以及质膜，并且为探测体内动态构象变化提供了更多样的策略。 本研究中，作者利用BLI 技术将整合 β2-AR的脂质体固定在 SA 传感器上，与 NB80 直接结合。验证两者之间具有很强的结合(如左下图示： KD=2.9nM)。同时发现，异丙肾上腺素((ISO)存在时，可以大大提高 B2-AR与 Nb80 的结合(如右下图示)。 ( 参 考 文献 ) 应用目的：利用 Octet 平台对混合物样品中目标靶分子进行垂钓并回收操作。 蛋白与未知 实验思路 在 OCTET上，一般用链霉亲和素琴(SA)传感器固化已知分子，如下图所示： 实验步骤 平衡(1分钟)粗样品中抓取特异结合分子(3-5分钟)洗脱(10秒)，重复30个循环 将洗脱的样品进行质谱分析 用 OCTET 可以实现全自动的垂钓检测，，可以实时检测是否有特异性物质被钓取，然后用质谱或者电镜进行分析。 李易真，上海交通大学医学院，血液研究所陈竺实验室 关键词：基因调控，白血病致病机理 AML1/ETO 融合蛋白对 t(8；21)急性白血病的形成非常重要，，它与野生型的 AML 形成复合物，结合在基因组上的相邻序列。 通过 CHIP-Seq 和生物信息学的手段发现，在AML1/ETO与AML1复合物识别的 DNA序列上，-2富集了一个长的DNA序列(5TGTGGTTT3’)和一个短的 DNA序列(5’-TGTGGT)，后者包含在了前者中。为了量化验证两个序列对 AML1/ETO 或者 AML1 的识别的特异性，用BLI技术检测包含短序列的两个 DNA片段(S1，S2) 和两个长序列 DNA片段(L1， L2)与 AML1/ETO或者 AML1 的亲和力。 可见， AML1/ETO 与 S1，S2 的亲和力远远高于L1，L2；而AML1 与 L1， L2的亲和力高于S1， S2。说明前者特异的识别短序列，而后者特异识别长序列。这个结果与EMSA以及 CHIP-qPCR的结果一致，但是BLI技术能够更快得到更加定量化的结果。 ( 参 考 文献 ) 3.10 DNA- 蛋白相互作用研究 与白血病相关的基因组功能研究 蛋白与核酸 Blood _ Probes containing the short AML1 motifsS1：5-TCCGGTGGTGC TGTGGTCTGCCCCTGGAGA-3'3"-AGGCCACCACGACACCAGACGGGGACCTCT-5'5*-ACCACCTGCATTACCACAGCCTCCACGGTG-3'S2：3'-TGGTGGACGTAATGGTGTCGGAGGTGCCAC-5' Probes containing the long AML1 motifsL195'-GTGAGTACCCATGTGGTTTAACGCTTGACT-33'-CACTCATGGGTACACCAAATTGCGAACTGA-5'L25*-GCAGAAGGAAGCTGTGGTT7CTGGTCTTCCT-33-CGTCTTCCTTCGACACCAAAGACCAGAAGGA-5 DNA序列 AML1/ETO AML1 Association Dissociation Association Dissociation ：0.8-S1E S1 134.0nM 0.4· 44.6nM D.O· 14.8 nM 0 240480 720 96000 24048072)0960 .1.21s2 S2 .0.8· KD (M) AML1/ETO AML1 S1 2.37E-09 4.55E-06 S2 3.33E-10 6.70E-07 L1 1.32E-04 1.08E-06 L2 1.38E-07 2.57E-09 Lsm1-7/Lsm2-8 对 8A，8U的亲和力结果 (将RNA固化在链霉亲和素传感器上与蛋白质相互作用) 本文解析了U6小核核糖核蛋白中 Lsm 蛋白质七聚体复合物 Lsm1-7 的晶体结构。 Lsm1-7通过识别3'端的mRNA 白 oligo A 或者 oligo U 的结构，介导mRNA从5'端的降解。应用生物层干涉技术比较了 Lsm1-7 和另外一种U6小核核糖核蛋白 Lsm2-8与 mRNA 末端的5'-AAAAAAAA-3'和 5'-UUUUUUUU-3'的亲和力，从生化分析角度解析Lsm1-7 的功能。 Lsm1-7 对 8A，8U的亲和力都是uM级别，但是对 8U有一定选择性(KD=2uM， 比 8A 的6uM强三倍)。而Lsm2-8对8U的亲和力(nM级别)远远高于8A(uM级别)，说明Lsm1-7 和 Lsm2-8对8A的结合模式一致，而 Lsm2-8对8U的结合特异性更好。 突变体亲和力分析获知， Lsm2/3/4/6上的 Arg 突变成Ala 后，对8U的亲和力下降显著，但是这些突变并没有导致对8A亲和力的大幅度下降，这个可能就是因为Lsm1-7对 8U的有一定选择性结合引起的。 3.12核酸适配体 ((Aptamer) 研究 利用核酸适配子检测小分子毒素 蛋白与核酸 高顺祥，王梁华，第二军医大学 关键词：适配子，信号放大法，贝类提取液 Biosensors and Bioelectronics b GIX 1/4 0- 50 100 150 200 Time (sec) 信号放大后的 PTX浓度依赖信号 BLI技术适用于适配子与靶点的亲和力验证。用链霉亲和素传感器固化生物素化适配子，检测 GTX (膝沟藻毒素)的亲和力。而该适配子与其他类型的贝类毒素(STX，GTX2/3)不反应或者反应非常弱。 BLI技术还可以实现对毒素的浓度测定。用固化适配子的传感器，检测不同浓度的 GTX1/4。左图可见，浓度与信号曲线在0.2ng-90ng/ml范围内呈现良好的线性关系。 BLI技术也可以用竞争法和信号放大的方式建立基于适配子的毒素高灵敏度检测方法。 先将海葵毒素 PTX固化在氨基偶联传感器((AR2G) 上，然后将传感器与 HRP (辣根过氧化物酶)偶联的适配子和含有 PTX 的样品的混合物孵育，然后用 HRP 的底物DAB 进行信号放大。如果 PTX 的混入浓度越高，检测的信号越低。整个实验只要10分钟就可以完成。检测极限为 0.04pg/ml。 将 PTX 加入到不同贝类的提取物中进行检测，，已知浓度为 50，200，800pg/ml，然后将计算的浓度与已知浓度进行比较获得回收率，每个实验重复三次。回收率在100.27%-108.24%之间，说明贝类海鲜的提取物基质对检测没有明显影响。变异系数在2.27%-6.76%之间，说明该方法的重复性非常好。 ( 参 考 文献 ) ( G o ny a utoxin 1 / 4 a ptamers with h igh-affinity and high-specificity：F r om efficient se l ection to aptas e nsor a ppli cation. S hunxiang Gao， et a l. B i o sens B io e lectro n . 20 1 6 M ay 15 ；79：938-4 4 ) ( Enzyme-linked， a ptamer - based， competitive biolayer interferometry biosensor f o r palyt o xin. Shunxiang G ao， e t a l. Volume 8 9， P art2， 1 5 March 201 7 ， Pages 952-958 ) 3.13小分子化合物筛选 基于生物层干涉技术的小分子片段化合物筛选 小分子化合物 Charles A等，罗氏，纳特利研发中心 关键词：生物层干涉技术BLI，片段筛选，蛋白-蛋白 J Comput Aided Mol Des 相互作用，药物发现， FBDD 基于生物传感器的片段化合物筛选是药物研发过程中一个非常具有价值的工具。这种方法优于许多其他的生化方法，因为初级苗头化合物可通过具体的结合图谱以及响应值有效地从非特异性或非理想的相互作用中区分开来，从而减少假阳性。来自罗氏公司的研究人员利用 BLI 技术通过模型系统和充分验证的靶点进行了小分子的检测和片段化合物的筛选验证，获得的亲和力常数和结合效价与表面等离子共振技术((SPR)高度一致。 在该项研究中，研究人员重组表达纯化得到 AVI-Tag 生物素标记的蛋白或通过体外的方式标记生物素 (biotin-LCLC-NHSS)，将其固化至 SSA 传感器上。通过缓冲液建立基线噪音信号，以基线噪音信号的3倍标准差为 cut-off 值筛选苗头化合物。使用了包含6500种化合物的片段文库对设计 PPI 的 BCL-2、JNK1、elF4E 进行了筛选，比较了这些靶标苗头化合物的比率。其中， elF4E 同时包含PPI位点和核酸结合位点，与高通量的时间分辨荧光分析筛选得到的结果也进行了对比。 结果显示，BLI技术通过双扣除的方式(参比传感器与零浓度的分析物)，可以精准快速的进行数据的处理与分析(Figure1)，也在初级苗头化合物的筛选以及评估 (Figure 2， Figure 3)中具有非常好的应用价值，可帮助确认生化分析法得到的化合物， BLI 技术可鉴定非典型的结合(Figure3中F-I随着化合物的浓度提高并不能达到饱和信号，信号大于阳性化合物信号3倍以上，对于片段化合物不可能的慢解离)和筛选生化分析法未筛选得到的化合物。 ( 参考文献 ) 3.14先导化合物的验证和表征 溴结构域蛋白 BAZ2A/2B 选择性抑制剂的开发 小分子化合物 Chen P， Chaikuad A， Bamborough P， 牛津大学结构基因组学联盟， Nuffield 临床医学系关键词：Bromodomains、抑制剂、BAZ2A/2B、GSK2801 J.Med.Chem Bromodomains (BRDs) 是一类能够特异性识别乙酰化赖氨酸残基的保守蛋白结构域，存在于染色质及与转录相关的蛋白中，在细胞内由乙酰化介导的蛋白-蛋白相互作用中发挥极为重要的作用，是多种疾病(包括癌症、炎症和自身免疫疾病)的表观遗传医学靶点。包含 BRDs的 BAZ2A 和 BAZ2B 蛋白是核仁重塑复合体(NoRC) 的中心支架蛋白，而 NoRC 在调节非编码 RNA 的表达和抑制异染色质的形成方面发挥了作用。 目前， BRDs 已经成为重要的药物作用靶点，，已有众多针对 BRDs 蛋白为靶点的小分子抑制剂成功开发，但 BAZ2特异性的抑制剂还未见报道。 在本篇文章中，研究人员通过其他技术筛选得到了先导化合物，通过对侧链的修饰得到了 BAZ2 的特异性抑制剂 GSK2801，并且 GSK2801具有很好的特异性。通过生物层干涉技术进一步验证了 GSK2801与 BAZ2B的结合，亲和力为60nM ((下图a)，， 与 ITC结果一致，但BLI技术可以实时监测分子间的相互作用的整个过程，GSK2801 与 BAZ2B 的结合呈现快结合与快解离的结合模式(K.1.57 ±0.02×10Ms； Koff6.95±0.058 × 10sl)。 BLI 技术通过对候选物的亲和力以及解离动力学数据进行甄选，有效地避免了在研发后期因不理想的结合表征数据而导致的项目失败。 高通量筛选激活素受体拮抗剂 小分子化合物 Jie Zhu， Rama K. Mishra，美国西北大学，费恩伯格医学院与生殖科学中心 关键词：虚拟高通量筛选，激活素， NUCC-47， NUC-55， ZINC 数据库 J.Med.Chem 激活素属于 TGF-B超家族的一员，与多种疾病相关，包括癌症、早产、骨质疏松等。靶向激活素及其相关的信号通路中的蛋白有望作为治疗这些疾病的治疗手段。先前的研究显示阻断激活素的信号通路，， 可逆转多种疾病的发展，但目前并没有有效的激活素的拮抗剂具有足够高特异性用于临床上治疗激活素信号通路介导的疾病。研究人员通过激活素晶体结构筛选用于特异性破坏配体/受体相互作用和激活素信号传导的小分子结合口袋。再通过计算机模拟 ZINC 数据库虚拟筛选了1800万的化合物，综合考虑最终筛选得到39种化合物。研究人员继续通过 FSHB转录、HepG2细胞凋亡、抑制卵巢细胞体外增殖和卵巢切除小鼠中激活素刺激的 FSH的拮抗功能分析，筛选得到两种先导化合物：NUCC-47和NUC-55， Figure 1 体内实验显示 NUC-C55是最有效的化合物，导致卵巢切除小鼠 FSH 水平的剂量依赖性降低。 研究人员利用 BLI 技术分析了 NUCC-555 对激活素和其配体结合的影响，竞争结果显示 NUCC-555 可竞争激活素和其配体的结合，研究人员将激活素配体ALK4-ECD-Fc 固化至ProA传感器上，计算NUCC-555 对激活素与 ALK4-ECD-Fc竞争影响，如图 (Figure1)所示随着 NUCC-555的浓度提高，由于 NUCC-555 与 ALK4-ECD-Fc 竞争结合激活素导致激活素与 ALK4-ECD-Fc 结合信号降低。由此证明NUCC-555 是选择性的竞争抑制激活素和其酉体的结合，而不抑制肌骨素与其配体的结合 (Figure2)。 3.15天然产物/中药的研究 枸杞多糖 LBPF4-OL 在 TLR4-MAPK信号通路中活性功能的研究 小分子化合物 军事医学科学院，毒物药物研究所 关键词：枸杞多糖，TLR4-MAPK信号通路， LPS， 诱导剂 International Immunopharmacology 枸杞多糖是一类重要的免疫调节剂，但其分子机制尚不清楚。在本研究中，研究人员报道了从枸杞多糖中纯化的多糖 LBPF4-OL 与 TLR4-MAPK 信号通路密切相关。研究发现LBPF4-OL 能显著诱导野生型小鼠 (C3H/HEN)腹腔巨噬细胞中TNF-a 和IL-13的产生，而不能诱导TLR5缺陷小鼠(C3H/HEJ)。同时， LBPF4-OL刺激的C3H/HEJ小鼠淋巴细胞的增值明显弱于 C3H/HEN小鼠淋巴细胞。 用生物层干涉技术分析 LPS 和 LBPF4-OL的相互作用， TLR4融合表达 FC 标签后通过 AHC 传感器固化至生物传感器表面，结果显示 TLR4的激活剂 LPS 可以与其直接结合，但 LBPF4-OL 并不能与 TLR4 结合 (Figure 1) 。流式细胞术分析表明， LBPF4-OL 可以显上上调腹腔巨噬细胞和 Raw254.7细胞中 TLR4/MD2 的表达。进一步的实验结果表明 LBPF4-OL增加 p38 MAPK 的磷酸化且抑制 JNK 和 ERK1/2的磷酸化。这些实验结果显示，枸杞多糖 LBPF4-OL是一种新的 Toll 样受体4/MD2-MAPK信号通路的激活剂和诱导剂。 参考文献 Zhang XR， Qi CH， Cheng JP， et al. Lycium barbarum polysaccha-ride LBPF4-OL may be a new Toll-like receptor 4/MD2-MAPK signaling pathwayactivator and inducer. /nt Immunopharmacol.2014；19(1)：132-141. 新藤黄素衍生物抗肿瘤机制的研究 小分子化合物 Wangxu，上海交通大学，附属第九人民医院 关键词：热休克蛋白70羧基端相互作用蛋白，共价抑制剂，EZH2，肿瘤 The EMBO Journal 蛋白，泛素化 ( 参考文献 ) 3.16G蛋白活性调控研究 揭示14-3-3通过磷酸化蛋白抑制G蛋白的全新机制 蛋白与多肽 Philippe Riou， 伦敦国王大学， Randall 细胞与分子生物系 关键词：蛋白相互作用，G蛋白，磷酸化，Rnd 研究发现 Rnd 蛋白属于非典型G蛋白，其活性调控并非通过经典的 GTP/GDP 转化机制。Rho (Rnd3、Rdn2、Rnd1))GTP酶家族具有 GTP 结合活性，但由于关键位点氨基酸的突变导致其与 GDP 的结合极弱，引此 Rho 的活性调控存在与其他典型的G蛋白调控不一样的途径。对于 Rnd3来说，其中一种机制是通过被 Rho 相关蛋白激酶1和蛋白激酶 C (PKC)a 磷酸化，将 Rnd3 亚细胞定位从质膜转移到细胞质中，增加其稳定性。但这种效应的分子机制仍未被阐明。 研究发现 Rnd C 末端被 ROCK1 和 PKC磷酸化后与14-3-3相互作用， Rnd3 需要C末端240位的 ser 磷酸化和241位的 cys 法尼基化才能稳定结合到14-3-3上。14-3-3通过结合Rnd3 诱导其从细胞膜到细胞质的迁移而抑制Rdn3的生物学功能，从分子层面上阐明了 Rnd 蛋白 活性调控的机制。通过解析 Rnd C- 末端肽段与14-3-3晶体复合体的结构发现，14-3-3精确地通过疏水界面与三异戊二烯基团结合。 研究人员采用生物层干涉技术BLI 在蛋白水平进一步验证含不同修饰的 Rnd3 C 末端短肽与 14-3-3的结合动力学，精确定量比较不同修饰的 Rnd3修饰后与14-3-3蛋白的结合。并且鉴定出14-3-3结合需磷酸化残基和最少两个异戊二烯基，14-3-3的结合口袋也能容纳更长的三戊二烯基(F)和四戊二烯基 (GG) (Figure1)，且BLI 的结果与 ITC 的结果一致。以及磷酸化和四异戊二烯基(GG) 的RaplA 短肽呈现约 24nM 的亲和力与14-3-3结合，磷酸化和非四异戊二烯基 (GG) 的RaplA短肽则是微摩尔级的，空白对照则无结合。(KD= 24nM forRap1A+P+GG，>1uM for Rap1A+P-GG， Figure 2) ( 参 考 文献 ) ( R i ou P Kja er S， G a rg R， et al. 1 4 -3- 3 proteins inte r act with a hybrid pren yl -ph o sphorylati o n motif to i nhibit G proteins.[JJ. Cell，2013， 153(3)：6 4 0- 65 3 . ) 通过无序结构蛋白实现低氧应答的高灵敏终止 蛋白与多肽 Rebecca B. Berlowl，美国斯克利普斯研究所，综合结构与计算生物学系与 斯卡格斯化学生物学研究所 Nature 关键词：低氧应答，无序结构蛋白，构象改变 TAZ1 细胞对缺氧的反应对细胞的生存至关重要，，'它能使细胞从缺氧压力中恢复，并适应不同的或波动的氧气水平。转录因子 HIF-1a亚基与转录辅激活因子 TAZ1 结构域结合并启动低氧应答，而 CITED2 竞争性抑制二者的结合以终止应答。本研究通过结构分析发现，三者形成的瞬时三元复合体会促进 TAZ1 构象改变并使 HIF-1a 解离，揭示了细胞快速应答低氧信号的结构基础。 HIF1a 和 CITED2， 被称作固有无序蛋白(intrinsicallydisordered proteins ， IDPs)。它们本身都不会折叠成稳 如果采用传统的分析方法，只能得到是否有结合的定性结果，而在该项研究中， TAZ1 与 GST 融合表达后通过anti-GST 传感器将 GST-TAZ1 固化至传感器表面，精确定量分析了 TAZ1 与 HIF1a 和 CITED2 亲和力大小。结果显示 HIFla 和 CITED2 与 TAZ1 亲和力相等，荧光异向性(fluorescence anisotropy) 结果与 BLI检测结果一致。 ( 参 考 文献 ) ( Ber lo w ， R . B.， Dyson， H . J. and W right， P . E . (2017 ) . H y persensitive termi n ation of the hypoxic respo n se by a d i sordered protein sw it ch. Na tu re 5 43，447-451. ) 3.18细菌感染机制研究 豆科植物识别固氮菌的机理研究 蛋白与多糖 Y.Kawaharada，丹麦奥胡斯大学，碳水化合物识别和信号研究中心 关键词：豆科植物根瘤菌，胞外多糖 (EPS)，胞外多糖受体 (EPR3) Nature 根瘤菌感染豆科植物，在根部诱导固氮根瘤的形成。这种共生关系在农业生产上有重要意义。豆科植物在它们所碰到的数千种不相容的土壤细菌中是怎样识别这些有益的共生伙伴的呢?在这项研究中，Stougaard 团队发现豆科植物是根据入侵细菌细胞表面上的“胞外多糖”(Exopolysaccharides， EPS) 来辨别细菌属性的。而负责识别的是一种“胞外多糖受体”.92 (EPR3)，该受体能识别与其相容的胞外多糖，从而控制共生性感染 (Fig.1)。研究中发现了很多证据表明 EPR3受体可以有效识别 EPS， 但最直接的方法无疑是检测 EPR3 与 EPS 之间的结 合亲和力。经由 SEC 得到纯化的 EPS，标记生物素后，固化到链霉亲和素生物传感器表面；分析物则是 EPR3胞外结构域(Fig.2)。分析得到两个分子间的结合亲和力为 2.7uM(Fig.3)，用麦芽六糖设为对照，则与 EPR3之间没有特异性结合。 生物层干涉技术作为体外测定方法，显示EPR3胞外域可以通过直接结合识别单体 EPS 并有效区分麦芽六糖。生物素化的多糖可以快速方便的固化到链霉亲和素传感器表面。 Figure 3 3.19抗病毒活性分析 岩藻糖化糖胺聚糖与 HIV-1的抑制活性和构效关系 Wu Lian， 赵金华，中国科学院昆明植物研究所，植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室 关键词：岩藻糖化糖胺聚糖(FG)， HIV， CD4，构效关系((SAR)，竞争关系 蛋白与多糖BiochimBiophys Acta. HIV-1包膜糖蛋白120 (gp120)可识别细胞 CD4 的CD4i区域。CD4i 被视为是抑制 HIV-1进入细胞的潜在目标。从海参中提取的岩藻糖化糖胺聚糖 (FucosylatedGlycosaminoglycan， FG) 是一种新型硫酸化多糖，其细胞毒性小，具有较强的抑制 HIV-1病毒活性。作者通过生物层干涉技术详细研究了这种机制，分析了FG抗 HIV-1 活性的分子动力学。利用竞争性抑制试验和抗HIV-1活性分析以及凝血活性，建立了FG 的结构和生物活性之间的关系。 特异性结合，而与 CD4分子没有结合(Fig.1A)。通过多浓度的动力学测定表明 FG3 与 gp120的结合作用非常强，亲和力达到4.27nM(Fig.1B). 在 FG3 与 gp120结合的基础上，作者又建立了基于 BLI技术的竞争性抑制试验。将不同浓度的肝素 (Heparin)、硫酸葡聚糖(DexS) 以及 FG混入一定浓度的 gp120/scd4 复合物中，然后与固化在 SA 传感器上的 FG3 相互作用，来观察它们对 FG3 和 gp120分子相互结合的影响(Fig.2)。实验结果表明，在 CD4存在下，抑制 gp120 结合实验显示 FG 的衍生物 FG3 与 gp120分子之间存在 结合的效力谱是 FG> DexS>Heparin。 参考文献 Lian W， Zhao J， Anti-HIV-1 activity and structure-activity-relationship study of a fucosylated glycosaminoglycan from an echinoderm bytargeting the conserved CD4 induced epitope. Biochim Biophys Acta. 2013 Oct； 1830(10)：4681-91 超级细菌多药耐药性研究 蛋白与脂质 Esther Garcia-Fernandez 等，西班牙国家研究委员会 (CSIC) 国家生物技术中心 关键词：金黄色葡萄球菌，脂筏 (lipid raft)，微结构域(FMM)，葡萄球菌黄素(staphyloxanthin) Cell 来自西班牙的研究团队发现，在超级细菌的细胞膜上存在着被称作脂筏 (lipid raft) 的微结构域(FMM)。这些由脂质和蛋白组成的微结构域，负责组装多种和抗生素耐药性相关的蛋白，使得细菌对常见抗生素产生耐药性。 研究者以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 为主要研究对象。应用 BLI技术，分析了 flotillin (脂筏蛋白)的一系列突变体和 staphyloxanthin (葡萄球菌黄素，一种 流感病毒与受体的相互作用 病毒研究 Xiaoli Xiong 等，英国医学研究理事会国立医学研究院关键词：流感病毒，H7N9， H5，受体，唾液酸类似物，血凝素 Nature 流感病毒通过识别细胞表面的受体进行感染，禽类受体是 a2，3-连接唾液酸，而人类受体是 a2，6-连接唾液酸。禽流感病毒能够感染人类，就是因为流感病毒表面蛋白发生了突变，从而可以与人类受体结合所致。 英国的研究人员发现，细胞表面的受体密度与固化在FORTEBIO 链霉亲和素 i(SA)传感器上的受体密度非常接近。所以生物层干涉技术是非常好的研究流感病毒与其受体亲和力的工具，而且可以直接将病毒作为分析物。作者按不同密度将受体多糖固化在 SA 传感器上，然后与单一浓度(100pM)不同来源的流感病毒进行反应。以 固化密度和信号作图，曲线上升的越快，则说明亲和力越高。比如X-31型流感病毒，其对人类受体的亲和力比禽类受体的要强 (Figure 1)。这种方法可以最真实的反应人体环境中病毒的结合能力。 另一篇研究 H7N9 流感病毒的文章也使用了这个方法。从 Figure2可以发现，H5型病毒完全丧失了与禽受体的结合能力，仅保留了与人类受体结合能力；H7型病毒对两者的结合能力旗鼓相当；而H3型虽然与两者都可以结合，但明显与人类受体结合的能力更强。 ( 参考文献 ) 1.Xiong， X.， Steven J. Gamblin，et al. (2013). Receptor binding by an h7n9 influenza virus from humans. Nature， 499(7459)， 496-499. 2.Xiong， X.， etal. "Receptorbinding by a ferret-transmissible H5 avian influenza virus. "Nature 497.7449(2013)：392-6. 3.22埃博拉病毒研究 中和抗体抑制埃博拉病毒的机理研究 .病毒研究 John Misasi 等，美国国立卫生研究院(NIH)、清华大学和 Geisel 医学院等 关键词：埃博拉病毒(Ebola))：，中和抗体，结构，糖蛋白(GP)， NPC1 Science 研究人员在埃博拉幸存者体内分离到一株单克隆抗体(mAb114)，能够有效保护感染了埃博拉的猕猴。对mAb114 进一步进行结构和功能解析发现埃博拉病毒表面糖蛋白(GP)和人体内的内涵体和溶酶体上的NPC1受体发生结合，随之介导侵入人体。因此需要检测酸性条件下抗体与 GP 的结合能力，以及其阻断 GP与NPC1结合的能力。 Figure 1 是 mAb114 的 Fab片段分别在中性和酸性环境下与 GP 结合的数据，1可见该抗体在中性和 ( 参考文献 ) mAb114与 GP结合后，可进一步阻断其结合到 NPC1 上。应用 AR2G 传感器固化 GP， 并依次和抗体和 NPC1 受体结合。如果 NPC1 的结合信号大大降低，则说明抗体可以阻断两者的相互作用。 Figure 2是 NPC1 的结合，右边显示的是竞争抗体的名称。当mAb114 与之竞争时，NPC1的结合信号大幅降低，说明 mAb114 抗体可以有效阻断两者的结合反应，从而发挥中和功能。 3.23细菌与抗体互作 应用 Zipbody在大肠杆菌中辅助构建Fab Teruyo Ojima-Kato等，名古屋大学生物农业科学研究生院 关键词： E.coli， Fab， leucine zipper， Zipbody 细菌与抗体Protein Engineering，Design & Selection 在大肠杆菌表达体系中，研究者发现二聚化的亮氨酸拉链(leucine zipper) 可以融合抗体的重链(Hc) 和轻链(Lc)，加速 Hc和 Lc在大肠杆菌体内和体外表达系统中结合形成 Fab (Figure 1)。 通过这种方法，研究者得到了两个活性非常好的 Fab-LZA/LZB 和 Fab-Jun/Fos 重组抗体，，可以特异性、高亲和力的结合到 E. coli 0157 细胞表面。应用 Blitz 系统， ( 参考 文 献 ) 可直接检测大肠杆菌和抗体间的结合亲和力。研究者将大肠杆菌固化在 APS 传感器表面，不同浓度的 Fab 作为分析物，测定到的亲和力分别为20.9和15.9 nM (Figure2)。在这项应用中，大肠杆菌细胞完整的被固化在传感器上，并直接进行检测，避免了无法表达获取表面蛋白抗原的问题。 ( O jima-Kato， T eruyo， et al . " Z ipbod y ’le u c ine zipper-fused Fab in E. co l i in vitro and in vivo e x pression sy s tems."Pr o tein Eng in eering Desi g n& S el e c tio n P eds 29.4(2016)：149. ) 3.24细胞与分子互作 基于细胞的非标记互作分析 D.Verzijl等， Genmab 公司荷兰研发中心 Biosensors and Bioelectronics 关键词： Cell-based， 胶原 (collagen)，动态质量再分配 (Dynamic mass redistribution) 研究人员第一次成功的将活细胞固化在传感器上，并检测到细胞和其他分子间的相互作用。文中采用将胶原蛋白固化在 AR2G 传感器上，然后再将 A431 鳞状细胞癌细胞固化在胶原蛋白上，固化完毕后，用显微镜观察传感器表面的固化情况 (Figure1) 。 依赖效应 (Figure 2)。通过分析获得的亲和力值为2.2nM左右，与报道值一致。 用BLI技术检测表达在细胞表面的 EGFR 受体与 EGF的反应。结合信号随着浓度的增加而增加，有明显的剂量 文中还尝试了小分子化合物 (dopamine)、拮抗剂竞争以及抗体药物筛选等多项实验，均获取了理想的结果。作者还对信号产生的原理进行了阐述，认为是由动态质量再分配 (Dynamic mass redistribution) 效应引起了光干涉信号的变化。 Figure1固化 A431 细胞的传感器的显微镜观察结果 ( 参 考 文献 ) Verzijl， D，etal. "A novellabel-free cell-based assay technology using biolayer interferometry."Biosensors & Bioelectronics (2017)：388-395. 粗提物中小分子毒素浓度检测 Chris M. Maragos， 美国农业部国家农业应用研究中心 关键词：竞争法，玉米粗提液，呕吐毒素 National CenterforAgricultural Utilization Research 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deoxynivalenol， DON) 是禾本科镰刀菌和黑穗病菌的次级代谢产物。在全球范围内， DON的残留可以发生在诸如小麦、大麦和玉米等各种谷物中。为了保护人类和动物的健康，许多国家都建立了 DON 在谷物中限量的法规。在美国，人类食用的粮食中， DON 残留量不得超过 1mg/kg(1ppm)。 本文基于生物层干涉技术 (BLI) 的竞争法建立了在粗样品中进行小分子毒素的浓度测定方法。 实验步骤： ·将偶联了 DON 的 BSA 固化在 APS 传感器上·用酪蛋白封闭 ·将传感器孵育在 DON 抗体与含有 DON 面粉粗提物的混合液中 ·用甘氨酸缓冲液再生传感器，将抗体从传感器上洗下来 BLI检测灵敏度可以达到 0.1mg/kg；使用再生后的传感器，在0.2-5mg/kg范围内，平均回收率可以达到101.4%，RSD 为13.2%.并且传感器可以再生使用多次。检测8个样品的时间在10分钟左右。 本文证明 BLI 技术可以用于粗样品的精确检测，而且成本低，速度快。 ( 参 考 文献 ) ( C hris M . M aragos. D e tection of d eox y nivalen ol using biol a yer inter fe r om etry. M ycotox Re s ( 2 011) 27：157- 16 5 ) 3.26 纳米材料 磁性纳米材料检测 Satoshi Okada，麻省理工大学，生物工程学院 关键词：纳米颗粒，聚合与解聚，脑脊液 Nature Nanotechnology 磁性钙离子响应纳米材料(MaCaReNas) 是一种由脂质体包被的氧化铁颗粒，如果在钙离子和突触结合蛋白C2结构域(C2AB)存在的脑脊液中，这种纳米粒子可以聚合。如果没有钙离子，即使有 C2AB也不能聚合。功能磁共振(fMRI)可以用这种材料检测脑内钙离子流。 该纳米材料聚合与解聚示意图 将 C2AB 固化在 NTA 传感器上，与含有钙离子和不含钙离子的脑脊液中的 MaCaReNas 分别进行聚合和解聚。 纳米颗粒在有无钙离子的环境中聚合 (association) 和解聚 (dissociation) 图谱 可见，在钙离子环境中，MaCaReNas 结合一半的时间为 4.9s， 在无钙离子环境中， MaCaReNas 解离一半的时间为 4.1s，证实了这种纳米颗粒非常适合用于 fMRI 检测。 本文证明了 BLI 技术不仅可以检测纳米颗粒，也可以检测诸如脑脊液等粗样品。 ( 参 考 文献 ) 可调控的对蛋白有亲和力的分子印迹表面 刘震组，南京大学，化工学院 关键词：分子印迹，表面化学，有机溶剂耐受 Chemical Science 分子印迹是制备具有类似抗体或酶专一性仿生识别材料的重要技术，在生物传感、亲和分离和疾病诊断等领域具有广阔的应用前景。经过多年在硼亲和材料领域中的深入研究，研究人员发展出硼亲和可控定向表面印迹法。该方法能够便捷高效地制备出糖蛋白、聚糖和单糖的分子印迹聚合物。 该方法的原理见下图，先将模板分子固定到硼酸功能化的基质上，然后利用生物相容性良好的功能单体在基质表面聚合，形成合适厚度的印迹层以及与模板分子空间匹配的印迹腔。通过生物层干涉技术验证了目标蛋白与印记表面的特异性结合并精确计算了结合的强弱。所得分子印迹聚合物已经在疾病诊断、癌细胞靶向识别和活体单细胞分析等重要应用领域中展现出优越的分子识别性能。 实验步骤： ·将溶解在甲醇中的甲酰苯硼酸与 APS 传感器过夜孵育， 完成 APS 传感器表面的硼酸化； ·将一种蛋白(HRP)模板固化在传感器上； ·将可以实现自聚的多巴胺和氨基苯硼酸混合物沉积在传感器上，在传感器表面形成分子印迹层； 去除蛋白模板。这样就可以形成了对蛋白模板有亲和性的化学表面 然后用 BLI检测具有这种化学表面的传感器和HRP 蛋白模板的亲和力 可以发现，具有多聚物的传感器与 HRP 模板亲和力为1.2nM， 而与阴性蛋白几乎不反应。 BLI技术优势是可以长时间的耐受有机溶剂等苛刻的条件，而且可以在传感器表面固化或者沉积形成各种水溶性差的多聚物。 ( 参考 文 献 ) ( Affi nit y-tunable specific recognition o f gl ycoproteins v ia boronat e affinit y -based controll a ble o riented surfac e imprinti n g. Ch em. S ci .， 2018， Advance A rticl e ) ForteBio 仪器型号 4.1超高通量系统-Octet HTX 产品特点： ·1~96个检测通道，用户可自由选择 ·无与伦比的检测速度：快速全板检测，可在2分钟内为96个样品提供定量数据，也可在数分钟内完成全板动力学筛选，卓越的灵敏度，检测分子量下限低至150Da ·兼容96孔板与384孔板自动化检测，便于实验流程优化支持外接自动化工作站，批量检测和筛选样本，最大程度节约时间 ·增强版的数据分析软件，可进行多级实验设计，支持抗原表位分选的高级数据处理 4.2高通量药物筛选系统 - Octet RED384 产品特点： ·高灵敏度同时检测16个样品，兼具高通量及灵活性 ·兼容96孔板与384孔板，两个板位分析，最大限度改善工作流程 ·友好的软件界面为实验设计和数据分析提供了更多的功能； ·支持外接自动化工作站 ·小分子文库筛选和大量竞争性结合实验矩阵分析的首选 4.3非标记蛋白分析的引领者-Octet RED96e 产品特点： ·应用广泛：亲和力及动力学表征、药物筛选、蛋白定量检测、抗体筛选等 ·快速提供全方位数据： ka， kd， KD 等 FORTEBIO ·卓越的灵敏度，检测分子量下限低至150Da ·高通量8通道平行检测，更快速，更高效 ·实验温控范围：室温-10至40°C，支持样品防蒸发盖，使样品蒸发影响降到最低 ·全新报告编辑功能，用户自由定制实验报告 ·Octet HT 软件支持多实验分析，定制的报告和功能， 以支持21 CFRPart 11 4.4科研工作者的利器-Octet K2 产品特点： ·双通道检测系统，实验设计更为灵活 ·卓越的灵敏度，检测分子量下限低至150Da ·亲和力检测范围宽泛，轻松挑战检测极限 ·丰富的预设实验方案，互作分析轻松上手 ·超高的性价比，科研首选入门级设备 4.5 浓度定量专家-Octet Qke 产品特点： ·抗体、蛋白质、多肽等生物分子进行定量以及动力学表征测定 ·快速提供全方位数据： kon， koff， KD等 ·8通道平行分析，超高性价比，无惧粗样品干扰 ·分子量检测下限5KDa， 定量动态范围 0.05-2000ug/ml， 轻松实现蛋白快速定量 4.6灵活轻便的非标记分子互作分析 系统-Blitz 产品特点： 。便携式设计，可放置于任何地方 。单通道手动系统，灵活设计实验 ·仅需4uL样品，随时随地开展分析 ·蛋白无需标记，定量快速准确 ·轻松助力蛋白质表达水平监测、产品质控 氨基丙基硅烷传感器(APS， Aminopropylsilane) 用途描述：利用蛋白或膜片段上的疏水基团吸附到传感器表面，适用于动力学筛选和亲和力表征分析(kon， koff， KD)。 适用配体：蛋白，膜蛋白，脂类等 应用：动力学(K )货 号：18-5045 第二代氨基偶联传感器(AR2G， Amine Reactive 2nd Generation) 用途描述：蛋白样品可以以共价键的形式固定在传感器表面。通过 EDC/NHS的酯化反应，使得蛋白上的氨基基团和传感器表面的羧基基团形成酰胺键。第二代氨基偶联传感器增加了结合密度，固化条件也更为稳定，同时大幅降低了非特异性结合。该传感器适用于蛋白和抗体的动力学筛选，亲和力表征分析(kon， koff， KD) 以及先导物验证。 适用配体：蛋白，抗体或多肽等含有氨基基团样品 应用：动力学(K) 货 号：18-5092 链霉亲和素传感器((SA， Streptavidin) 用途描述：传感器表面包被有链霉亲和素，用以偶联生物素标记的抗体、蛋白、多肽或核酸等样品。适用于配体结合分析、亲和力筛选、hit的验证，表位配对以及动力学表征(kon， koff， KD)等分析测定。 适用配体：生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等 应用：动力学(K) 货 号：18-5019 高精度链霉亲和素传感器(SAX， High Precision Streptavidin) 用途描述：传感器表面包被有链霉亲和素，经专门开发和生产，适用于对数据结果的精确性和重复性有着严格要求的药物研发和质量控制实验室使用。严格的QC检测确保产品间的 CV<4%(实际性能可能会有不同、需根据客户的实验条件而定)。 适用配体：生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等 应用：动力学(K) 货 号：18-5117 高精度链霉亲和素传感器 (SAX 2.0 ， High Precision Streptavidin) 用途描述：固化生物素化分子，适用于高精度、高重复性动力学表征和浓度测定。 适用配体：生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等 应 用：浓度测定(Q)，动力学(K) 货 号：18-5136 超级链霉亲和素传感器 (SSA， Super Streptavidin) 用途描述：传感器表面包被有超高密度链霉亲和素，用以标记的抗体、蛋白、多肽或核酸样品。特别适用于小分子化合物结合分析实验和化合物片段筛选。 适用配体：生物素化的抗体、蛋白、多肽或核酸等 应用：动力学(K) 货 号：18-5057 www.fortebio.com 抗人FC-捕获传感器(AHC， Anti-Human Fc Capture) 用途描述：利用特异性结合人源抗体Fc区域，将人IgG 或其他人 Fc 融合蛋白固化于传感器之上。主要应用于动力学测定，包括蛋白和抗体的筛选、亲和力表征 (ka，kd，KD)，抗原表位配对以及 hit 的验证。 适用配体：人源IgG 抗体(IgG1，IgG2，IgG3，lgG4) 应用：动力学(K) 货号：18-5060(1盒)，18-5063(5盒)，18-5064(20盒) 抗人 FC-定量传感器 (AHQ， Anti-Human IgG Quantitation) 用途描述：特异性结合人源抗体 Fc 区域或人 Fc 融合蛋白。主要用于在细胞培养、克隆选择、生产工艺优化以及产品质控等各个环节中，定量检测人 IgG 浓度。 适用配体：人源IgG 抗体 用：浓度测定(Q) 应 货 号：18-5001(1盒)，18-5004(5盒)，18-5005(20盒) 抗鼠 FC-捕获传感器 (AMC， Anti-Mouse Fc Capture) 用途描述：利用捕获的方法，特异性结合鼠源抗体的 Fc区域。主要应用于抗体-抗原亲和力分析 (ka， kd， KD)以及基于解离速率的抗体筛选。 适用配体：鼠源IgG抗体(IgG1，IgG2a，IgG2b，lgG3) 应用：动力学(K) 货 号：18-5088 抗鼠FC-定量传感器 (AMQ， Anti-Murine IgG Quantitation) 用途描述：特异性结合大鼠或小鼠 IgG 抗体的 Fv(ab’)2区域。主要用于在细胞培养、克隆选择、生产工艺优化以及产品质控等各个环节中，定量检测大鼠或小鼠 IgG 浓度。 适用配体：鼠源IgG抗体 应用：浓度测定(Q) 货 号：18-5022 第二代抗人Fab传感器；((FAB2G， Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation) 用途描述：特异性结合人 IgG抗体的CH1区域，适用于人源 Fab 和 IgG 的定量检测和动力学表征分析。与自由轻链不存在结合。 适用配体：人源IgG抗体 应用：浓度测定(Q)，动力学(K) 货 号：18-5125 SARTORIUS 抗体传感器 Protein A传感器 (ProA， Protein A) 用途描述： Protein A 可高亲和力结合人 IgG 的Fc区域，与鼠或兔众多的 IgG亚型有较强结合。适用于细胞系开发、克隆筛选、过程优化以及产品监控等诸多应用中的 IgG定量测定。 适用配体： IgG抗体本(人、鼠、兔等) 用：浓度测定(Q) 号：18-5010 Protein G 传感器 (ProG， Protein G) 用途描述：Protein G 可高亲和力结合大小鼠、山羊或牛 IgG， 与不同亚型的人 IgG 有较强结合。适用于细胞系开发、克隆筛选、过程优化以及产品监控等诸多应用中的 IgG 定量测定。 适用配体：IgG抗体(人、大鼠、小鼠、山羊、牛等) 应用：浓度测定(Q) 货 号：18-5082 Protein L传感器(ProL， ProteinL) 用途描述： Protein L 可高亲和力结合大部分大鼠、小鼠以及人的免疫球蛋白中的 kappa 轻链。不与山羊、牛、兔以及绵羊的 IgG结合。适用于定量测定血清培养基中 IgG 或 Fab 片段。 适用配体： IgG抗体或Fab片段(人、大鼠、小鼠等) 用：浓度测定(Q) 号：18-5085 抗 GST 传感器 (GST， Anti-GST) 用途描述：通过高亲和力的抗 GST 抗体，既可以直接对 GST 融合蛋白进行快速定量；也可以稳定地捕获 GST 融合蛋白用于动力学分析。 适用配体：含有GST 标签的重组蛋白 应 用：浓度测定(Q)云动力学(K) 货 号：18-5096 抗六价HIS传感器(HIS1K， Anti-Penta-HIS) 用途描述：通过 Qiagen 公司的六价 His 抗体，特异性、高亲和力的捕获带有 His 标签的重组蛋白，适用于定量检测和动力学分析。 适用配体：含有HIS标签的重组蛋白 应 用：浓度测定(Q)动力学(K) 货 号：18-5120 抗 HIS 传感器(HIS2， Anti-HIS) 用途描述：通过包被在传感器表面的抗 His 单克隆抗体，直接捕获和检测带有 His 标签的重组蛋白，适用于定量检测。 适用配体：含有HIS标签的重组蛋白 应用：浓度测定 (Q) 货 号：18-5114 NTA传感器(NTA， Ni-NTA) 用途描述：带有 His标签的重组蛋白可通过镍离子介导，与传感器表面的NTA紧密结合，适用于定量检测和动力学分析。 适用配体：含有 HIS 标签的重组蛋白 应 用：浓度测定(Q)动力学(K) 货 号：18-5101 抗 CHO宿主细胞蛋白检测试剂盒(Anti-CHO HCP Detection Kit) 用途描述： Anti-CHO HCP检测试剂盒是由 ForteBio 和 Cygnus公司联合开发，用于定量检测产品中的 CHO 细胞宿主细胞蛋白(HCP)残留。利用快速、高通量的Octet分析平台，结合 Cygnus 3G anti-CHO HCP 抗体的宽识别度和高灵敏度特性，使得 HCP检测两全其美。 (更多信息，，[可在 ForteBio 网站下载 Technical Note 41： CHO Host CellProtein Detection) 产品特点：全自动HCP检测；；一小时完成整个96孔板分析；检测灵敏度低至0.5 ng/mL；检测精度高， CV范围5-10%货 号：18-5081 蛋白A残留检测试剂盒 (Residual Protein A Detection Kit) 用途描述： Protein A 残留对于抗体药物生产质量是一个重要的指标。 Protein A 残留检测试剂盒包含特制的生物传感器和所需试剂，用于检测抗体产品中Protein A 或 MabSelect SuRe 等填料残留量。 (更多信息，可在 ForteBio 网站下载 Technical Note 18： Dip and Read Residual Protein A Detection Kit) 产品特点：定量检测 Protein A 或 MabSelect SuRe 残留；检测方法灵敏且精确；操作简便、易于使用；自动检测，手工操作大幅减少 货 号：18-5075 GlyS 唾液酸化筛选检测试剂盒 (Sialic Acid Kit) 用途描述：用于细胞上清液粗样品或纯样品中唾液酸的相对定量。 (更多信息，可在 ForteBio 网站下载 TechnicalNote ： Sialic Acid Kit User Guide) 产品特点：不需要将样品纯化或消化处理，可节省多达3个小时的样品准备时间；综合滴度结果与唾液酸化数据，尽早选择理想的表达株 货 号：18-5135 SARTORIUS www.fortebio.com联系我们Hotline：400-920-9889Email：fortebiosh@Sartorius.com赛多利斯(上海)贸易有限公司上海市浦东新区张江高科技园区金科路4560号1号楼北楼3层www.sartorius.com ww.fortebio.com Octet时光匆匆，2020年已经过去，留下了将近2000篇Octet相关的文献。陈老湿在前一期已经给大家总结了全年的文献之最，今天就给大家解读一下去年12月份的文章精选。既有组蛋白突变与淋巴瘤发病机制关系，也有血清中直接检测新冠病毒抗体方法建立，还有中和抗体关键表位识别对东部马脑炎病毒抑制作用的重要性，以及破伤风疫苗诱导的中和抗体对小鼠的保护作用分析等。Nature组蛋白突变与淋巴瘤发病机制[1]威尔康奈尔医学院等机构的科学家们通过研究发现，组蛋白H1的突变或是诱发淋巴瘤的原因。组蛋白会参与到DNA的卷绕并包装成为一种特殊结构的过程中。淋巴瘤相关的H1蛋白的突变会干扰组蛋白结合并收紧DNA的能力，使得DNA变得更加松散，原本被抑制的基因就会活跃起来，从而促进早期发育阶段的基因表达异常。淋巴瘤或许就源于此。研究人员分析并比较了一组101个DLBCL患者机体中H1突变和其它基因突变的频率，发现有5种不同形式的H1会在分裂的细胞中发挥作用，其中H1C和H1E的两种突变是淋巴瘤的最常见驱动突变。这对如何利用H1突变来开发淋巴瘤的新型疗法提供启示。与野生型相比，H1蛋白C端突变体S102F与单核小体的亲和力显著变弱，即突变会使得H1蛋白丧失正常的结合功能活性Scientific Reports新冠血清学快速诊断方法建立[2]加州大学圣克鲁兹分校的研究人员采用Octet高通量分子互作平台开发了新冠病毒抗体血清学检测方法，集高通量、快速和准确定量于一身，并将其命名为“BLI-ISA（生物层干涉免疫吸附法）”。将新冠病毒S-RBD固定在生物传感器上，然后浸入1:8或者1:16稀释的血清样品中，即包含IgG,IgA等所有抗体的总的结合信号。然后再结合胶体金标记的抗人IgG或抗人IgM抗体，体现了IgG或IgA等抗体的特异性结合信号。BLI-ISA检测方法37个血清样品的检测结果（含新冠病毒抗体阴性，弱阳，强阳血清）BLI法可以准确地区分所有阴性与阳性样品BLI-ISA法30分钟内完成检测（包括操作和运行），仅为ELISA法的十分之一Octet一方面可以在血清等粗样品中直接检测，还可以通过整合自动化装置，大幅度提高检测通量，实现长时间的无人值守。Cell马脑炎病毒中和抗体关键表位分析[3]东部马脑炎病毒(EEEV)是北美地区流行的毒性最强的病毒之一，目前还没有正式的疫苗或抗病毒疗法。范德堡大学等机构的研究人员从EEEV自然感染的康复者体内分离鉴定出了部分单克隆抗体。其中EEEV-33(IgG)和EEEV-143 (IgA) 两株抗体，表现出较高的EEEV抑制活性（IC50分布为3.1和2.8pM）。10株不同的中和抗体的结合表位结构解析通过分析不同抗体与EEEV病毒的复合物结构，表明EEEV-33结合病毒抗原的Domain A，EEEV-143则结合Domain B。这些抗体可识别不同的抗原位点，这对抑制病毒进入细胞至关重要。其中，EEEV-33和EEEV-143对高致病性EEEV感染的小鼠具有良好的保护作用。这些研究为EEEV中和抗体反应的分子机理提供了基础，有助于疫苗和候选抗体疗法的开发。将重组EEEV E2糖蛋白固定在HIS1K生物传感器上，结合第一抗体(50 ug/mL)，再结合第二抗体(50 ug/mL) 。将没有结合第一抗体的第二抗体的结合作为最大信号，其他结合过第一抗体的第二抗体信号降低到33%以内的，认为是与第二抗体完全竞争关系。二抗信号降低到33 ~ 67%之间，认为是部分竞争关系。而二抗的信号在67%以上，则认为是不竞争的Octet在早期筛选中快速准确地进行抗原表位分析，这在埃博拉病毒，寨卡病毒以及新冠病毒的中和抗体开发与设计中均发挥了重要作用，贡献良多。InternationalImmunopharmacology破伤风疫苗的抗体保护作用分析[4]破伤风梭菌产生的破伤风神经毒素(TeNT)毒性极大，尤其是感染后潜伏期短、发病快，加剧患者的致命风险。开发和设计抗TeNT的中和抗体即是预防和治疗的有效手段之一。北京生物工程研究所的陈薇院士组从一名免疫了TeNT的C端结构域(TeNT- hc)的健康成人体内，分离了记忆B细胞，并鉴定了一系列单克隆抗体。其中13株抗体可与破伤风类毒素(TT)和TeNT-Hc结合，另两株抗体则只识别TT。T3、T7和T9-6这三株抗体可以完全保护小鼠免受TeNT的感染，T2和T18则可显著延长存活时间。这五个中和抗体识别不同的抗原表位。该研究提供了治疗和预防破伤风神经毒素的有潜力的候选药物。免疫接种过程AHC传感器固定不同的抗体结合TT，5株中和抗体均具有较强的结合，亲和力KD在0.123 ~ 11.9 nM之间Octet陈老湿在整个2020年给大家推荐了五十篇左右的优质文献，Octet以其结果准确、快速便捷、功能全面等特点为广大科研机构和制药企业提供了有力地可靠工具。同时，用户也是各种不同新应用的开发者，脑洞够大才能化繁为简，直达目标。Octet，让分子互作不再复杂-参考文献-[1] Yusufova, N et al., Histone H1 loss drives lymphoma by disrupting 3D chromatin architecture. Nature 589, 299–305 (2021).[2] John V. Dzimianski et al., Rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 antibodies by biolayer interferometry. Scientific Reports 10:21738(2020).[3] Williamson et al., Human Antibodies Protect against Aerosolized Eastern Equine Encephalitis Virus Infection. Cell 183, 1884–1900 (2020).[4] Guanying Zhang et al., Tetanus vaccine-induced human neutralizing antibodies provide full protection against neurotoxin challenge in mice. International Immunopharmacology 91, 107297 (2021).