洁净空气中微生物菌落检测方案(微生物采样器)

SARTORILS 简介 应用说明 2021年6月 关键词或短语： 凝胶膜过滤器、洁净室、EN17141、ISO 14698、微生物学、空气监测 根据 EN 17141 和 ISO 14698，使用凝胶膜过滤器进行洁净环境中的空气监测 Claudia Scherwing， Eric C. Arakel² 1德国哥廷根赛多利斯斯泰迪生物科技有限公司实验室基础应用开发 2德国哥廷根赛多利斯实验室仪器有限责任公司微生物产品管理 通讯作者 电子邮箱： claudia.scherwing@sartorius.com及eric.arakel@sartorius.com 摘要 根据悬浮粒子的浓度对受控环境进行分类，并规定了其中的非携菌粒子和携菌粒子的限值。因此，生物污染控制策略是最新标准和指导方针如EN 17141及欧盟GMP附录1的修订版本的关键要求。欧盟和英国已采用了2020年发布的EN 17141取代ISO14698。EN 17141附录E章节对基于培养技术的微生物监测方法和取样器验证指南作了详细的说明。本应用说明重点关注活性微生物监测，并证明通过凝胶膜过滤技术进行的微生物空气监测符合EN 17141和ISO 14698的要求，其中ISO14698仍然是欧盟和英国以外国家和地区所采用的标准。 无菌和生物制药生产中必须实施生物污染控制策略。要实现这些控制，就需要精心设计工艺以免污染、实施监测系统以检测污染、以及实施补救策略以迅速解决污染事件。未能实施这些策略往往会造成严重的后果。 生产工艺中会存在多个污染源，并且每一次常规干预都会增加污染风险，例如，塞子重新填装及更换空气监测板。因此，微生物环境监测计划(包括体积空气取样)对于确定生物污染预防措施的效率来说至关重要。 空气污染物可通过主动取样进行测量，而主动采样需要使用专业的设备主动抽取规定体积的空气。这便于准确测量每立方米(m3)的空气中的微生物菌落形成单位(CFU)。 采样器效率可分为物理效率和生物效率。物理效率是采样器收集的微生物数量与取样空气体积中存在的总数量的比率。生物效率是从空气样本中回收的活性微生物数量与预期收集的数量的比率。这可测量取样过程中产生的影响。 EN 17141标准中了定了验证空气采样器适用性的附加要求。附录E提供了有关基于培养基的空气取样方法和验证要求的信息。其要求确定空气取样方法的物理和生物取样效率。 EN 17141标准要求测定 d50值，以确定取样器的物理效率。d50值是50%的粒子可被收集，而其余粒子碰撞法逃逸的粒径。粒径大于 d50 的粒子的回收概率更高，反之亦然。 该标准规定，形成CFU的微生物携带粒子(MCP)的平均等效直径通常大于1um，且认为合适的 d50 值应小于2 um。该标准还规定，可以确定具有多孔(筛子)或矩形槽(狭缝)的碰撞取样器的 d50 值，且仅在进行比较时才需要。 由于凝胶膜过滤(GMF)法是基于过滤技术，因此 d50值不适用于该方法。相应的，该标准规定了过滤法滤膜的保留率。 我们的研究结果表明，凝胶膜过滤法对不同粒径的枯草芽孢杆菌孢子的保留率都达到了 97.996%以上。 对于两种标准中的生物取样效率，膜过滤法被定义为参考方法。 为了证明其对范围更广的空气微生物的采样性能，也同样在环境空气中测试GMF法。 我们证明，即使在连续采样8小时后，微生物回收率也未受到干扰，而且长期采样也未造成不良的影响。 凝胶过滤器的标称孔径为 3um，这是根据空气流速间接决定的。尽管如此，凝胶过滤器具备深层过滤器(如HEPA H14过滤器)的截留能力，另外由于筛分和扩散效应，几乎可完全截留病毒。总而言之，凝胶过滤器专为可靠、连续、无干预的微生物空气监测而设计。我们的结果表明，无需重新鉴定赛多利斯微生物空气监测仪器和耗材，并且凝胶膜过滤方法符合EN 17141 和ISO 14698 的要求。 枯草杆菌黑色变种芽孢(1.2umx0.8 um)是一种能够承受雾 物理采样效率化压力的强健微生物。 我们使用旋转顶部气溶胶发生器在受控环境室中生成含有不同大小的活枯草芽孢杆菌孢子颗粒的微生物气溶胶。我们将含有0-7%(重量/体积百分比)碘化钾(KI)的80%乙醇的孢子悬浮液(约106 CFU/ml)注入气溶胶发生器中。颗粒的大小可通过旋转顶部的速度和悬浮液中的KI浓度来调节。 与气溶胶发生器等距放置的采样器可同时采集样本。 截留率 我们通过使用雾化枯草芽孢杆菌孢子进行的细菌激发试验(BCT)测定出了凝胶膜过滤器的截留率。在BC试验中，我们使用了1.2*105CFU/cm²枯草芽孢杆菌孢子来挑战凝胶过滤器，然后检测过滤后的空气是否受到枯草芽孢杆菌的污染。 图1：用1.2*105 CFU/cm?的枯草芽孢杆菌孢子进行激发试验后得出的凝胶膜过滤器截留率。 凝胶过滤器对枯草芽孢杆菌孢子的最高截留率>97.996%(图1)。 结果表明，0.8 um和16um之间颗粒的收集效率没有显著的差异(图2)。 图2：与Casella狭缝取样器相比，凝胶膜过滤器在不同粒径的1.2*105 CFU/cm²枯草芽孢杆菌孢子激发时的物理取样效率。 粒径(um) 生物采样效率 人们普遍错误地认为，通过所有膜过滤器吸入的空气造成的脱水会对植物微生物的生存能力产生不利的影响。我们的试验结果表明，凝胶膜过滤器可以可靠地收集空气中的携菌颗粒，且不会降低回收率。 凝胶过滤器与传统的薄膜过滤器不一样，其具有吸湿性并能吸收环境中的水分。而这种残留的水分会形成了一种保护性衣壳，保护了易受脱水胁迫影响的微生物。 我们通过从含有植物细菌的气溶胶中取样，并将其与实验室自然空气中的微生物回收率进行比较，测定出了凝胶过滤法的生物效率(1)。 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 通过喷贲在环境室内生成含有枯草杆菌黑色变种孢子(1.2 umx0.8 um)和革兰氏阴性大肠杆菌(2umx1um)混合物的气溶胶。 我们的结果表明，与Casella狭缝取样器相比，大肠杆菌与枯草芽孢杆菌孢子之间的比率没有显著差异(图3)。这也证实，基于凝胶膜过滤的空气采样不会对植物微生物的生存能力产生不利的影响。 图3.与Casella狭缝取样器相比，凝胶膜过滤器的悬浮大肠杆菌/枯草芽孢杆菌孢子生物取样效率。 大肠杆菌/枯草杆菌芽孢子的比率 所述试验的完整报告可在审计期间审查。 连续微生物空气监测(8h) 我们证明，在从环境空气中连续采样8小时后，与对照组相比，平均CFU计数没有显著的变化。此外，与仅30分钟的采样周期相比，微生物范围没有显著的变化(摘自我们的第二份应用说明：图4和图5)。 图4.与取样30分钟后直接放置在营养培养基上的凝胶过滤器相比(参照)，取样(试验)8小时后凝胶膜过滤器上的微生物回收率。 130 图5.在凝胶过滤器上取样8h(A)后与取样30 min后直接放置在营养培养基上的凝胶过滤器(B)的回收菌种范围比较。 病毒检测 尽管超出了本应用说明的范围，但值得一提的是，独特的凝胶膜过滤器已成功应用三十余载，可从空气样本中采集病毒样本。在2013年的中东呼吸综合征爆发期间(5)，凝胶膜过滤器用于采集中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)样本，以及最近的严重急性呼吸综合征暴发期间(7)，用于采集冠状病毒(SARS-CoV-2)样本。研究表明，凝胶膜过滤器的物理效率超过 96%，即使病毒粒子小于 80 nm，效率也是如此(4)。我们自己的数据显示T1噬菌体和T3噬菌体的截留率分别为99.9%和99.94%(2、3)。凝胶膜过滤法也被用作比较采样器在病毒采样方面的物理和生物采样效率的参考方法(4、6)。有关更多信息，请参阅我们关于病毒采样的应用说明。 ▪在特定时间内增加流速或延长采样时间，检测洁净室中微生物负载满足洁净实验室通常要求。通过该方法可进行大容量采样和/或长期采样，并在8小时内连续收集空气，而不会对微生物回收产生不利影响。 ▪避免将营养培养基引入隔离器/灌装线。 营养培养基不会因脱水而造成水分流失。 ·由于凝胶膜过滤器容易溶解在琼脂表面，因此，可确保从孔结构中轻松回收微生物。 ·在典型工作班次8小时的取样期间，可避免操作员干预(例如，频繁更换培养基板)。欧盟GMP附录1的2020年修订版本规定，应避免因环境监测操作干预而引起的任何风险。该规定还强烈建议在实施干预措施后以及在洁净室的每个出口对人员进行监控。 ▪经证实的病毒截留率有助于监测空气中传播的外来病毒。 MD8 Airscan@经过专门的开发，主要用于洁净室环境，不会干扰气流模式。取样头可集成到关键控制点的隔离器、灌装线或其他洁净室环境中，并可进行等速取样。取样头(整个气流路径)可以通过汽化/气相过氧化氢(VHP)进行消毒。 采样量可通过空气流速来调节，并可通过集成式空气流量计来持续监控。凝胶膜过滤器具有多种配置，可满足每一种微生物检测需求。其中包括伽马灭菌单袋和三袋装凝胶膜过滤器或Biosafe@袋装凝胶膜过滤器，用于通过Biosafe@快速转移端口无菌转移到隔离器、RAB和洁净室中。使用Biosafe@袋，即无需在VHP去污之前加载高级无菌处理系统。 图6.包括安装在洁净室环境中的MD8 Airscan°取样头及预灭菌凝莫膜过滤器一次性用品的凝胶过滤法。 结论 我们已经证明，与Casella采样器相比，凝胶膜过滤器的截留率超过 97.996%，物理取样效率超过 80%。在EN 17141和ISO14698标准中，膜过滤法被指定为高效生物取样的参考方法。尽管如此，我们还是将我们的凝胶膜过滤法的生物效率与Casella取样器的生物效率作了比较，并证明，与Casella取样器相比，革兰氏阴性大肠杆菌与枯草芽孢杆菌孢子的比率没有差异。 即使经过8小时的采样期，凝胶膜过滤法的高生物采样效率仍保持不变。连续采样也不会对过滤器的平均CFU计数以及回收的微生物种类范围产生不利的影响。 ( 参考文献 ) ( 1. C. Scherwing，F. Golin， O. G uenec， K. Pflanz， G.Dalmaso， M. B ini， F. Andone， Continuousmicrobiological air monitoring for aseptic filling lines，PDAJ P h arm Sci Technol， March/April 2007 61：102-109 ) 2. Jaschhof H.1992a. Sampling virus aerosols-comparative studies on the efficiency of gelatinmembrane filters，impaction collectors and impingers.Bio Tec； 4 (English translation). 3. Jaschhof H.1992b. Sampling virus aerosols using thegelatin membrane filter-collection using a membranefilter at a high sampling rate. Bio Tec；6 (Englishtranslation). .4 Zhao et al.， 2014. Airborne virus sampling-Efficienciesof samplers and their detection limits for infectiousbursal disease virus (IBDV). Annals of agricultural andenvironmental medicine：AAEM 21(3)：464-71 5 Azhar El et al.2014.Detection of the Middle Eastrespiratory syndrome coronavirus genome in an airsample originating from a camel barn owned byaninfected patient. mBio 5(4). 6. Friese A. 2010.Aerogene Ausbreitung von Viren： EineStudie verschiedener Sammelgerate undQuantifizierungsmethoden zur Virusisolierung aus derLuft. Dissertation zur Erlangung des Grades einesDoctor medicinae veterinariae (Dr. med.vet.)amInstitut fur Tierhygiene und OffentlichesVeterinarwesen derVeterinarmedizinischen Fakultatder Universitat Leipzig. /. Liu Y etal.2020. Aerodynamic characteristics and RNAconcentration of SARS-CoV-2 aerosol in Wuhanhospitals during COVID-19 outbreak. bioRxiv. 销售与服务联系方式 更多联系信息，请访问 www.sartorius.com.cn 赛多利斯(上海)贸易有限公司 邮箱lab.cn@sartorius.com 服务热线 400 920 9889|800 820 9889 上海北京上海市浦东新区盛荣路 388北京市顺义区空港工业区 B弄百佳通产业园3号楼区裕安路 33号， 1013007-11层，200120电话+86 10 8042 6300 电话+86 21 6066 6100苏州广州 苏州市虎丘区科技城锦峰路广州市越秀区水荫路 117 号 158 号 101park-28 幢201，1105单元， 510075 215163电话+8620 3761 7284 电话+86512 6616 0490 成都西安成都市上东大街 246号新良西安市和平路 118 号和平银大厦2406室， 610012座1107室， 710001电话+86 28 8666 6877电话 +86 29 87512305 ( 技木规格如有变更，恕不另行通知。 ) ( 赛多利斯保留最终解释权和修改权。 ) ( 版本02|2022 ) Overview生物污染控制策略是新标准和指导方针如EN17141及欧盟GMP附录1的修订版本的关键要求。欧盟和英国已采用了2020年发布的EN17141取代ISO14698。EN17141附录E章节对基于培养技术的微生物监测方法和取样器验证指南作了详细的说明。Download本篇《根据EN17141和ISO14698，使用凝胶膜过滤器进行洁净环境中的空气监测》应用说明重点关注活性微生物的监测，并证明通过凝胶膜过滤技术进行的微生物空气监测符合EN17141和ISO14698的要求。点击下载 获取全文简介无菌和生物制药生产中必须实施生物污染控制策略。要实现这些控制，就需要精心设计工艺流程以免污染、实施监测系统以监测污染、以及实施补救策略以迅速解决污染事件。空气污染物可通过主动采样进行测量，而主动采样需要使用专业的设备主动抽取规定体积的空气。这便于准确测量每立方米（m3）的空气中的微生物菌落形成单位的数量（CFU）。采样器效率可分为物理效率和生物效率。物理效率是采样器收集的微生物数量与取样空气体积中存在的总数量的比率。生物效率是从空气样本中回收的活性微生物数量与预期收集的数量的比率。物理采样效率枯草杆菌黑色变种芽孢（1.2μm x 0.8μm）是一种能够承受雾化压力的强健微生物。在受控环境室中使用旋转顶部气溶胶发生器生成含有不同大小的活枯草芽孢杆菌孢子颗粒的微生物气溶胶。将含有 0 - 7 %（重量/体积百分比）碘化钾（Kl）的 80%乙醇的孢子悬浮液（约 106CFU/ml）注入气溶胶发生器中。颗粒的大小可通过旋转顶部的速度和悬浮液中的KI浓度来调节。与气溶胶发生器等距放置的采样器可同时采集样本。截留率通过使用雾化枯草芽孢杆菌孢子进行的细菌激发试验（BCT）测定出了凝胶膜过滤器的截留率。在BC试验中，使用了 1.2 * 105 CFU/cm² 枯草芽孢杆菌孢子来挑战凝胶过滤器，然后检测过滤后的空气是否受到枯草芽孢杆菌的污染。凝胶过滤器对枯草芽孢杆菌孢子的最高截留率 > 97.996%（图1）。图1：用 1.2 * 105 CFU/cm²的枯草芽孢杆菌孢子进行激发试验后得出的凝胶膜过滤器截留率。物理采样效率结果表明，0.8μm和 16μm之间颗粒的收集效率没有显著的差异（图2）。图2：与Casella狭缝取样器相比，凝胶膜过滤器在不同粒径的 1.2 * 105CFU/cm²枯草芽孢杆菌孢子激发时的物理取样效率。生物采样效率试验结果表明，凝胶膜过滤器可以可靠地收集空气中的携菌颗粒，且不会降低回收率。通过从含有植物细菌的气溶胶中取样，并将其与实验室自然空气中的微生物回收率进行比较，测定出了凝胶过滤法的生物效率。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌通过喷洒在环境室内生成含有枯草杆菌黑色变种孢子（1.2μm x 0.8μm）和革兰氏阴性大肠杆菌（2μm x 1μm）混合物的气溶胶。结果表明，与Casella狭缝取样器相比，大肠杆菌与枯草芽孢杆菌孢子之间的比率没有显著差异（图3）。这也证实，基于凝胶膜过滤的空气采样不会对植物微生物的生存能力产生不利的影响。图3.与Casella狭缝取样器相比，凝胶膜过滤器的悬浮大肠杆菌/枯草芽孢杆菌孢子生物取样效率。连续微生物空气监测（8 h）实验证明，在从环境空气中连续采样 8 小时后，与对照组相比，平均CFU计数没有显著的变化。此外，与仅 30 分钟的采样周期相比，微生物范围没有显著的变化（图4和图5）。图4.与取样 30 分钟后直接放置在营养培养基上的凝胶过滤器相比（参照），取样（试验）8 小时后凝胶膜过滤器上的微生物回收率。图5.在凝胶过滤器上取样 8 h（A）后与取样 30 min后直接放置在营养培养基上的凝胶过滤器（B）的回收菌种范围比较。凝胶过滤法的优点- 在特定时间内增加流速或延长采样时间，可进行大容量采样和/或长期采样，并在 8 小时内连续收集空气，而不会对微生物回收产生不利影响。- 避免将营养培养基引入隔离器/灌装线。- 营养培养基不会因脱水而造成水分流失。- 由于凝胶膜过滤器容易溶解在琼脂表面，因此，可确保从孔结构中轻松回收微生物。- 在典型工作班次 8 小时的取样期间，可避免操作员干预（例如，频繁更换培养基板）。- 经证实的病毒截留率有助于监测空气中传播的外来病毒。- 使用凝胶膜过滤器和快速检测法（PCR）。空气采样器技术性能MD8 Airscan® 经过专门的开发，主要用于洁净室环境，不会干扰气流模式。取样头可集成到关键控制点的隔离器、灌装线或其他洁净室环境中，并可进行等速取样。取样头（整个气流路径）可以通过汽化/气相过氧化氢（VHP）进行消毒。采样量可通过空气流速来调节，并可通过集成式空气流量计来持续监控。凝胶膜过滤器具有多种配置，可满足每一种微生物检测需求。MD8 Airscan®Conclusion实验结果证明，与Casella采样器相比，凝胶膜过滤器的截留率超过 97.996%，物理取样效率超过 80%。在EN17141和ISO14698标准中，膜过滤法被指定为高效生物取样的参考方法。尽管如此，我们还是将凝胶膜过滤法的生物效率与Casella取样器的生物效率作了比较，并证明，与Casella取样器相比，革兰氏阴性大肠杆菌与枯草芽孢杆菌孢子的比率没有差异。即使经过 8 小时的采样期，凝胶膜过滤法的高生物采样效率仍保持不变。连续采样也不会对过滤器的平均CFU计数以及回收的微生物种类范围产生不利的影响。结果表明，无需重新评价赛多利斯微生物空气监测仪器和耗材的功能，并且凝胶膜过滤方法符合EN17141和ISO14698 的要求。该方法还符合欧盟GMP附录1，2020年修订版中关于活性颗粒环境监测的规范。更多详细解读 敬请下载全文