空气中病毒检测方案(微生物采样器)

SARTORIUS 2020年4月 关键词或短语： 凝胶过滤器、MD8Airport、MD8 airscan、病毒采样、空气监测、采集效率、人类致病病毒检测、水溶性、小样品体积、样品制备、RNA提取、RT-qPCR 使用凝胶膜过滤器从空气中采集人类致病病毒并通过PCR分析进行后续检测 Claudia Scherwing1，Dr. Diana Patzelt1 1.实验室基础应用产品开发，德国哥廷根赛多利斯斯泰帝生物技术有限公司 *通讯作者 电子邮箱： claudia.scherwing@sartorius-stedim.com 1.引言 传染病的爆发是一个重要的全球公共卫生问题，且对全球经济和医疗体系构成深远的挑战和威胁。没有抗病毒治疗的病毒感染尤其具有威胁性，因此了解感染源和传播途径以及这些因素如何促进疾病传播，可以促进有效的预防及采取控制措施。 目前，COVID-19大流行证明了深入了解人类致病病毒在时间和空间上的传播和传染性的重要性。 除了液滴吸入、与被感染者密切接触或与被污染表面接触外，病毒的气溶胶传播也是需要考虑的一个重要因素1、4、5、8、9-11。 目前，由于病毒气溶胶采样存在困难且在低浓度下定量存在挑战，关于含SARS-CoV-2气溶胶的特性、浓度模式以及在空气传播过程中的行为等方面的信息很少。这种认识的缺乏限制了人们对COVID-19疾病爆发的有效风险评估、预防和控制8. 此外，还应观察隔离措施以及清洁和卫生处理程序的有效性8，例如在诺如病毒爆发后在游轮上进行的检查。 2020年Van Doremalen指出，致病病毒能够以气溶胶的形式持续数小时，长期存在于环境中。持续存在的病毒基因组甚至可以在释放后24小时以上检测到9.11。致病病毒也可通过空气远距离传播3。因此，开发和改进空气样品中病毒定量检测方法具有重要意义4。 然而，在这方面已经有了一些研究，关注空气作为病毒传播途径的重要性1.7.8。 这些研究的结果表明，空气传播病毒具有一定的稳定性，这取决于物种，并强调了空气监测对发现潜在感染源和确定传播途径的重要性。 尽管目前还没有正式的官方规定要求定期监测空气传播病毒，但多位关注这一问题的科学家强烈主张在病毒爆发期间进行空气监测。 凝胶过滤法是监测空气中病原微生物和病毒的一种简便、高效、灵敏的方法1、2、4.6.8。 水溶性凝胶过滤器对于冠状病毒采样的适用性已经得到了测试和证明1、4、6、7、8、10、11。 这些过滤器特别适用，因为它们具有优越的病毒采集效率，保留率高达99.76%26。 此外，使用凝胶过滤器的空气采样程序使得将检测下限扩展至102个粒子/米成为可能3.6。其提供了延长采样周期(高风量采样，如2000l)的选择，过滤面积高达50cm²( 80 mm)，流速高达50 I/min， 溶剂体积最小可减少到80-100pl/cm²过滤面积4、6.8。 ( 尽管如此，也可使用较小的过滤器尺寸，如47mm(过滤面积17 cm²)，因此溶剂体积可进一步减少至1.5-2.0 ml。 ) ( Jaschhof(1992a，1992b)和Friese证明了凝胶过滤器的高度 适用性，他们观察到在个别情况下，使用凝胶过滤器优于其 他病毒采样方法。 ) ( 这种效率是在不进行任何额外的准备或后处理步骤来进行 病毒气溶胶采样的情况下获得的，同时保持了过滤器一贯的 高保留能力。 ) ( 凝胶过滤器可用预组装和预消毒的即用型过滤单元。 ) 2.用凝胶膜过滤器采集空气中病毒 与轻便的便携式AirPortMD8采样器配合使用，凝胶过滤是一种特别适用于移动应用的方法，表现出卓越的易用性4.6。 除此之外， Jaschhof(1992b)还表明，采样持续时间和30℃下80%-85%的相对湿度不会对病毒的保留产生负面影响，平均保留率为99.76%。 另一个好处是，对人类致病病毒进行采样时，无需使用液体，从而降低了分析检测人员的感染风险。用凝胶过滤器采样后的病毒传染性有所降低1.4，这一研究结果被证明是有好处的，因为这些样品可被认为是非传染性物质。 此外，在采样后储存凝胶过滤器的选择!以及在溶解前将凝胶过滤器运送到实验室进行进一步分析的选择可能是有益的。 3.凝胶膜过滤器进行病毒PCR检测的处理 一旦将凝胶过滤器溶解于去离子水或任何其他适当的缓冲液或介质中，所有保留在过滤器上的病毒颗粒可使用PCR进行进一步处理和检测1、4、8、10、11。 为了获得快速、灵敏、高特异性和可靠的结果，对存在的特定病毒进行检测，实时定量PCR(qPCR)是首选的方法1.2.4.8。 凝胶过滤与qPCR相结合，甚至可以检测到敏感的RNA物质14、8、11 然而，应该考虑到， RNA提取是样品制备中的一个关键步骤。因此，为了减少遗传物质的损失，应特别注意这一步骤2.4。 多项研究表明，使用凝胶过滤器进行空气采样后再进行PCR分析，可提供优于其他检测方法的回收结果，因此，可以认为这是检测空气传播病毒的一种精确可行的方法4、7。 4.使用凝胶膜过滤器的典型空气采样程序以及后续用于PCR法检测空气传播病毒的样品制备 ( 1)打开080mm一次性凝胶过滤器的包装 (货号17528--80----ACD) ) ( 2)将一次性凝胶过滤器安装在赛多利斯MD8空气取样器 (AirPor t MD8(货号16757)或MD8 Airscan(货号16748)) 的过滤器支架上 ) ( 3)应避免触摸过滤器而造成污染 ) ( 4)以50 I/min的速度开始空气采样，持续20分钟(1000|是典 型的空气采样体积) ) ( 5)取样后，逆时针转动过滤器支架，将其与一次性凝胶过滤 器一起从MD8上拆下 ) 6)逆时针转动过滤器支架，使其顶部与底座分离 7)将080mm过滤膜插入15ml的Falcon管中，需注意过滤膜很容易破损(也可选择使用047mm的过滤膜) 8)可选择储存和|或运送至分析实验室 9)分别加入4-5ml或1.5-2ml(对于047mm过滤器)溶剂(例如无菌去离子水或适当的缓冲介质) 10)在离心机中以3000xg离心转 11)37℃下，在加热摇床(120rpm)或加热块中孵育10分钟，使凝胶溶解 12)选择性病毒灭活 13)按照生产商的说明进行RNA提取 14)溶解RNA 15)选择性添加核糖核酸酶抑制剂 16)立即在冰上处理或在-80℃下选择储存期 17)使用带有引物和dT oligo引物的商用试剂盒在热循环器中反转录合成cDNA 18)cDNA在-20℃下的选择性储存 19)进行PCR分析(如qPCR) 5.空气中人类致病病毒检测的应用领域 6.用于病毒采样及后续PCR检测的凝胶膜过滤器的关键特征 监测清洁和卫生处理程序的有效性 监测医院不同区域的病毒气溶胶传播情况，例如： ·采样效率高 ·患者区域 (高达99.9%的病毒颗粒保留率) ·医务人员区域(尤其是更衣室) ·与隔离区相邻的房间 ▪可对大体积进行采样(流速可调，过滤器直径可达080mm)，因此具有最高的灵敏度 公共区域 ·沉积区 ▪在高达30℃和80%-85%相对湿度的环境条件下的有效保留率 ·房间通风口 ·患者卫生间 "可溶于小体积液体(最小80-100ul/cm?过滤面积)，因此具有高灵敏度 "核酸回收率高 监测公共交通工具，例如： 采样无需使用液体 ·飞机 降低人类致病病毒的传染性 ·游轮 "采样后可储存 ·火车 采样后可干燥运送，无回收损失 ▪铁路车辆 ·渡船 "溶解的凝胶过滤器可用PCR等快速检测方法进一步处理"非常易于使用 监测游客流量大的公共区域，例如： 机场 ·火车站 识别和监测潜在感染染、传播途径或热点地区，例如： ·谷仓和马厩 ▪民众集会 图2：独立包装一次性凝胶过滤器。 ( 1. Azhar El， Hashem AM，El-Kafrawy SA， Sohrab SS， Aburizaiza AS， Farraj SA， Hassan AM，Al-Saeed MS， Jamjoom GA， Madani TA. 2014. D etection of the Middle East respiratory syndrome coronavirus genome in an air sample originating from a camel barn owned by aninfected patient. mBio 5(4). ) 2. Burton NC， Grinshpun SA， Reponen T. 2007. Physicalcollection efficiency of filter materials for bacteria andviruses. Ann Occup Hyg.51(2)：143-51. 3. Dee S， Otake S， Oliveira S， & Deen J.2009.Evidence oflong distance airborne transport of porcine reproductiveand respiratory syndrome virus and Mycoplasmahyopneumoniae. Veterinary research， 40(4)，39. ( 4. Friese A . 2010. Aerogene Ausbreitung von Vi r en：Eine Studie verschiedener Sammelgerate undQuantifizierungsmethoden zur Virusisolierung aus derLuft. Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctormedicinae veterinariae (Dr.m e d. vet.) am Institut furTierhygiene und Offentliches Veterinarwesen derVeterinarmedizi n ischen Fakultat der Universitat L e ipzig. ) 5. ljaz MK， Karim YG， Sattar SA， Johnson-Lussenburg CM.1987.Development of methods to study the survival ofairborneviruses.Department of Microbiology andImmunology， School ofMedicine， University of Ottawa. 6. Jaschhof H.1992a. Sampling virus aerosols-comparativestudies on the efficiency of gelatin membrane filters，impaction collectors andimpingers. Bio Tec； 4(English translation). 7.Jaschhof H.1992b. Sampling virus aerosols using thegelatin membrane filter-collection using a membranefilter at a high sampling rate. Bio Tec； 6 (Englishtranslation). 8. Liu Y， Ning Z， Chen Y， et al.2020. Aerodynamiccharacteristics and RNA concentration ofSARS-CoV-2aerosol in Wuhan hospitals during COVID-19 outbreak.bioRxiv. 9.van Doremalen N，BushmakerT Munster VJ.2013.Stability of Middle East respiratory syndromecoronavirus (MERS-CoV) under different environmentalconditions. Euro Surveill.18(38). 10. van Doremalen N， BushmakerT Morris DH， et al.2020.Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 asCompared with SARS-CoV-1.N EnglJMed. 11. Walenda T. 2007.Transmission von Viren uber raum-lufttechnische Anlagen. Diplomarbeit am Institut furLaboratoriums- und Transfusionsmedizin Herz- undDiabeteszentrum Nordrhein-Westfalen Universitats-klinik der Ruhr-Universitat Bochum in Bad Oeynhausen. 了解更多信息，请登录： www.sartorius.com 图：使用次性凝胶过滤器与MD Airscan或便携式AirPort MD组成空气采样装置。 COVID-19的大流行让病毒的气溶胶传播愈加引人关注。据报道，致病病毒能够以气溶胶的形式持续数小时，长期存在于环境中。持续存在的病毒基因组甚至可以在释放后24小时以上被检测到。致病病毒也可通过空气远距离传播。因此，开发和改进空气样品中病毒定量检测的方法具有重要意义。使用凝胶膜过滤器采集空气中病毒凝胶过滤法是监测空气中病原微生物和病毒的一种简便、高效、灵敏的方法，其中水溶性凝胶过滤器对于冠状病毒采样的适用性已经得到了测试和证明。- 凝胶过滤器的空气采样程序可将检测下限扩展至102个粒子/米，并能延长采样周期（高风量采样，如2000 l）- 凝胶过滤器的过滤面积高达50cm²（Ø 80mm），流速高达50 l/min- 溶剂体积最小可减少到80–100μl/cm²过滤面积，同时也支持较小的过滤器尺寸，如Ø47 mm（过滤面积17 cm²），因此溶剂体积可进一步减少至1.5–2.0 ml）- 这种高效率的病毒气溶胶采样是不需要进行任何额外的准备或后处理步骤的凝胶过滤可以与轻便的便携式AirPort® MD8采样器配合使用，是一种特别适用于移动应用的方法。此外，采样持续时间和30℃下80%–85%的相对湿度也不会对病毒的保留产生负面影响，平均保留率为99.76%。值得一提的是，使用凝胶过滤器对人类致病病毒进行采样时，无需使用液体，因此大幅降低了分析检测人员的感染风险。经过凝胶过滤器采样后的病毒传染性有所降低，样品可被认为是非传染性物质。使用凝胶膜过滤器进行病毒PCR检测一旦将凝胶过滤器溶解于去离子水或任何其他适当的缓冲液或介质中，所有保留在过滤器上的病毒颗粒可使用PCR进行进一步处理和检测。凝胶过滤与实时定量PCR（qPCR）相结合，甚至可以检测到敏感的RNA物质。多项研究表明，使用凝胶过滤器进行空气采样后再进行PCR分析，可提供优于其他检测方法的回收结果。因此，可以认为这是检测空气传播病毒的一种精确可行的方法。使用凝胶膜过滤器的典型空气采样程序以及PCR样品制备1. 打开Ø80 mm一次性凝胶过滤器的包装（货号17528--80----ACD）2. 将一次性凝胶过滤器安装在赛多利斯MD8空气取样器（AirPort MD8（货号16757）或MD8 Airscan（货号16748））的过滤器支架上3. 应避免触摸过滤器而造成污染4. 以50 l/min的速度开始空气采样，持续20分钟（1000 l是典型的空气采样体积）5. 取样后，逆时针转动过滤器支架，将其与一次性凝胶过滤器一起从MD8上拆下6. 逆时针转动过滤器支架，使其顶部与底座分离7. 将Ø80 mm过滤膜插入15 ml的Falcon管中，需注意过滤膜很容易破损（也可选择使用Ø47 mm的过滤膜）8. 可选择储存和|或运送至分析实验室9. 分别加入4–5 ml或1.5–2 ml（对于Ø47 mm过滤器）溶剂（例如无菌去离子水或适当的缓冲介质）10. 在离心机中以3000×g离心11. 37℃下，在加热摇床（120 rpm）或加热块中孵育10分钟，使凝胶溶解12. 选择性病毒灭活13. 按照生产商的说明进行RNA提取14. 溶解RNA15. 选择性添加核糖核酸酶抑制剂16. 立即在冰上处理或在-80℃下选择储存期17. 使用带有引物和dT oligo引物的商用试剂盒在热循环器中反转录合成cDNA18. cDNA在-20℃下的选择性储存19. 进行PCR分析（如qPCR）相关产品  MD8 Airscan®空气采样器 凝胶过滤膜↓点击下载获得更多产品与应用支持↓