原生乳中黄曲霉毒素M1检测方案(液相色谱仪)

实验 结果版权所有 ◎2014， PerkinElmer， Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@是PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其他所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 序言 黄曲霉毒素B1是被任为最具致癌性/遗传毒性的，由黄曲菌菌株产生的毒素。曲霉属真菌，寄生曲霉真菌在食物，农作物或是收割的庄稼暴露在潮湿或温暖的温度下产生的。 当被乳牛吞咽下后，黄曲霉毒素B1被转化成黄曲霉毒素M1，虽然该毒素没有B1毒性强，但已经有事实表明在某些动物体内可以引起肝癌。 毒素在奶牛吃草/进食期间毒素易被吸收和浓缩，因此牛奶是特别容易受到黄曲霉毒素污染的。出于这种考虑， M1被认为是在牛奶中预期发现的主要的黄曲霉毒素，欧盟也相应地建立了牛奶中M1应急控制限度，限度为0.05 ppb。这是目前全球范围内就该检测项目而言控制最为严格的，比美国食药监局的 0.5 ppb 的限制还要低。 为了从分析层面上达到欧盟对M1 毒素非常低的控制限度，高效液相色谱仪 HPLC配有荧光检测器(FL)是首选的检测设备。使用这样的检测技术，以下描述了高效液相色谱来检测原料乳中ppb/ppt浓度水平的黄曲霉毒素M1的方法，使用简单的免疫亲和固相萃取法(SPE) 对原料样品进行制样/净化。虽然在本文中关注的是黄曲霉毒素M1，但在标准品和加标回收实验中都有黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2，这也是为了确认M1毒素和其他毒素色谱分离的效果。 硬件/软件 一套 PerkinElmer Altus高效液相色谱，其中包含A-10进样/溶剂管理模块，柱温箱和A-10荧光检测器(PerkinElmer， Shelton， CT， USA)). 一根 PerkinElmerBrownlee C18 色谱柱3um， 4.6×100 mm用于所有分析(PerkinElmer， Shelton， CT， USA)。所有的仪器控制，分析和样品处理都通过 Waters Empower 3 软件。 方法参数 表1显示了 HPLC 方法参数 表1：液相方法参数 HPLC条件 色谱柱 PerkinElmer Brownlee C18， 3 um， 4.6x100-mm (Part# N9303507) SPE 柱 Afla M1 immunoaffinity column， 3 mL (Vicam) 流动相 17：23：60乙腈/甲醇/水 分析时间 10 min 流速 1.1 mL/min.(2900 psi 最大压力) 柱箱温度 30°℃ 荧光检测器 Excitation (Ex)： 362 nm， Emission (Em)： 435 nm 进样体积 100 pL 采样速率 5 pts./sec 稀释液 Water 溶剂，标样和样品 所有的溶剂和稀释液都使用色谱级别的，并通过0.45um 膜过滤的。 从 Sigma-Aldrich 购买的10 ug 黄曲霉素毒素M1，用水制成10ug/mL (10 ppm) 的储存液。20ug/mL(20ppm)的黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2储存在乙腈中的标准溶液也是从 Sigma-Aldrich 购得的。10ppb的黄曲霉毒素标准工作液的准备是吸取100uL 的M1毒素储备液和50uL 的 B1/B2/G1/G2毒素夜备液置于100mL容量瓶，用水稀释到刻度线。为制作校准曲线，用水稀释黄曲霉毒素标品至3.82ppb， 0.764ppb， 0.382ppb， 0.0765ppb和0.0382ppb。 原料乳从当地保健食品商店购得。原料乳被等分成三份，每份40mL 进行检测。在50mL离心管里，加入一份原料乳样品并添加800 uL 3.82ppb 的黄曲霉毒素校准物，制成 0.0765ppb 加标样品。加标样品涡旋1 min， 然后通过转移4mL到另外一个50mL离心管里，加入36mL 水从而被稀释10倍，振动离心管使其混匀。同样将新制成的样品再次涡旋1min，然后在离心机5500 rpm转速下离心10 min。每20mL一份的脱脂上清液被装入3mL黄曲霉毒素M1免疫亲和柱中，以每秒1滴的速度进行洗脱，不要让亲和柱的填料变干。。-一旦柱子变干对吸附和解析的效果都会有影响的。随后，柱子用20mL的水，以每秒1-2滴的速度进行洗脱，直到空气通过柱子。当再次向 SPE 柱子添加 2.5mL的乙腈：甲醇(60：40)以1滴每秒的速度洗脱后，直至空气通过柱子，黄曲霉毒素M1被洗脱至15mL圆锥形底型的离心管中。每份洗脱液被弄干至100uL再加入水/甲醇(70：30)至2mL，装入进样小瓶1mL以备进样用(进样100uL)。 结果与讨论 图1显示了浓度浓度水平3(0.382ppb)校准物色剖图，图A是全视图，图B是放大后着重看M1 毒素的谱图。五种黄曲霉毒素在 6min 内均被等度洗脱分离。 A. 2.00 4.00 6.00 8.00Minutes G2 M1- G1A 人人_ B2 图1.浓度水平3 (0.382ppb)黄曲霉毒素校准物的液相色谱图；全视图A和放大图B 图2显示了重复十次进样浓度水平3的校准物得到的重现性结果，M1的保留时间重现性 RSD 值仅为 0.05%，从而展示了仪器优异的重现性。 为了考察交叉污染，当进完浓度水平 5 (3.82ppb)校准物三次后再进空白流动相。如图3显示，空白谱图显示未检测到交叉污染。 图6展示了连续进样3针加标 0.0765ppb 的原料乳重叠色谱图，从而可以看出其良好的重现性。 图3.进完三针浓度水平5后溶剂空白的色谱图 图6.连续进样3针加标 0.076Sppb 的原料乳重叠色谱图 图4显示了M1毒素校准谱图，校准曲线线性大于0.9999 三份加标原料乳的回收率显示在表2中。每个表格中给出的值都是三针重复进样得到结果的平均值。总体而言，考虑到提取后得到的样品基体差异较大且较低的分析物浓度，现得到的回收率是非常理想的。2号原料乳样品的回收率稍有些高，可能是由于弄干洗脱液后向里加入70：30比例的水/甲醇溶液至2mL时，刻度线的判断有失精准造成的。 图4.M1毒素线性校准谱图；浓度范围 0.0382-3.82ppb 表2.三针加标 0.0765ppbM1 毒素原料乳样品的回收率 黄曲霉毒素M1 按照 S/N > 10/1定义为定量限，按之计算其定量限为0.011ppb，意味着M1 毒素定量限可低于欧盟中对牛奶中毒素M1的限制要求。 样品 M1(%) 原料乳样品1# 97.8 原料乳样品2# 112.5 原料乳样品 3# 101.4 三份样品平均值 103.9 图5显示了加标 0.0765ppb 的原料乳的全视图和放大色谱图。运行时间延长至15min 用来确认在 11min 流出的未经确认的大峰。 值得注意的是，基于该加标样品计算M1 毒素定量限，其值为 0.014ppb， 同样也远远低于欧盟标准要求的控制限。 图5.加标 0.0765ppb 的原料乳色谱图。A)全视图；B)放大图 该项研究证明使用 PerkinElmer Altus 高效液相色谱配有荧光检测器和免疫亲和 SPE 柱进行净化可对黄曲霉毒素M1有效的分离和定量分析。结果在超出测试浓度范围外都展现出了超乎想象的线性。所得到的定量限可<0.02ppb，并可获得良好的回收率。小于0.02ppb 的定量限不仅可用于常规M1毒素分析，同时也小于原料乳中 0.05ppb的控制限，并也满足欧盟检测要求。 ( 注释：如果要检测全脂奶和1%脂肪含量的牛奶中的黄 曲霉毒素M1，B1，B2， G1和G2，请参考文献 ) ( 1. FDA Compliance Policy Guide， under Inspections，Compliance， E n forcement， an d Criminal Inv e stigations；CPG Section 5 27.400 Whole Mi l k， Lowfat Milk， Skim Milk -Aflatoxin M1 ) ( 2. Commission R egulation (EU) No 165/2010. AmendingRegulation (EC) No 1881/2006 Setting Maximum Levels for Certain Contaminants in F o odstuffs as Regards Aflatoxins. Official Journal of the European Union， F eb 26， 2 010， p p L 50/8- L 50/12. ) 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999www.perkinelmer.com.cn 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：//www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs