牛奶中黄曲霉毒素M1、AFM1检测方案(液相色谱仪)

LAAN-A-LC-C052 ApplicationnNo.L506Newshttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2016年6月400-650-0439 ApplicationNews 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography 使用Prominence-i和荧光检测器RF-20Axs根据通知检测法测定牛奶中的黄曲霉毒素Mi No.L506 Assay of Aflatoxin M1 in Milk Based on Notification Test Methodology， Using Prominence-i and the RF-20Axs Fluorescence Detector 黄曲霉毒素M1(AFM1)是一种具有致癌性的霉菌毒素。若哺乳类动物食用被黄曲霉毒素 B1污染的饲料，则其乳汁中可检测到该成分。 在2015年7月23日日本颁布的《有关牛奶中含有黄曲霉毒素M1的处理》(食安发0723第1号)中，规定牛奶中AFM1的上限值为 0.5 ug/kg， 并从2016年1月23日起开始执行。 在同时颁布的《有关牛奶中含有黄曲霉毒素 M1的试验方法》(食安发0723第5号)2)中收录了两种检测方法，具体如下： ①使用带有荧光检测器的 HPLC 进行定量，然后使用 LC/MS或者LC/MS/MS 进行确认的方法 ②使用分析试剂盒的筛选法 本文向您介绍根据方法①对市售牛奶进行分析的示例。使用一体型 HPLC Prominence-i 和荧光检测器RF-20Axs， 对牛奶中的AFM1进行分析。由结果可知，该方法对牛奶中AFM1检测浓度为上述法规上限的1/10。 ■标准溶液的分析 Analysis of Standard Aflatoxin Mi Solutions 图1为分析AFM1的标准溶液(0.1 ug/L，相当于法规规定的上限值1/100的浓度)得到的色谱图。表1为分析条件。结果得出，重复分析6次得到的峰面积相对标准偏差(%RSD)为3.4%。图2为浓度范围在0.1~20 ug/L 的标准曲线。在此浓度范围的相关系数达到R²=0.9999以上，表示线性良好。由此可知，使用荧光检测器RF-20Axs 可对极微量的 AFM1 进行高灵敏度、高精度分析。另外，按照图3所示的通知检测法进行预处理后，标准溶液0.1 ug/L相当于法规规定的牛奶中AFM1上限值的1/100(0.005ug/kg)。 表1HPLC分析条件 HPLC Analytical Conditions 仪器 ：Prominence-i 色谱柱 ： Shim-pack VP-ODS (150mm L.x4.6 mmI.D.， 5 um) 流动相 ：水/乙乙=3/1(v/v) 流速 ： 1.0 mL/min 柱温 ：40℃ 检测器 ： RF-20Axs， Ex.365 nm， Em. 435 nm 流通池 ：标准池 流通池温度 ： 25℃ 进样体积 ： 100uL 图1相当于上限值1/100 浓度(0.1 ug/L) 的 AFM1标准溶液的色谱图(重复测定6次) Chromatograms for Standard AFM1 Solution Equivalent to 1/100ththe Regulatory Concentration (0.1 ug/L， Test Repeated 6 Times) 图2AFM1标准曲线 AFM1 Calibration Curve (0.1-20 pg/L) Analysis of Aflatoxin M1 in Milk 作为食品样品的分析示例，我们对市售牛奶以及在市售牛奶中添加了AFM1的样品进行了分析。通过添加AFM1，将牛奶中AFM1浓度配制为0.05 ug/kg(上限值的1/10)，并按照通知检测法”对该浓度样品进行预处理。图3为预处理步骤。有关详细内容，请参考通知检测法”。 使用 Romer Labs 公司生产的免疫亲和柱 AflaStarTMR*去除杂质。图4为分析该成分得到的色谱图。其中(A)为添加了AFM1的牛奶， (B) 为未添加AFM1的牛奶。 分析条件与图1相同，如表1所示。 ※ AflaStar 是 Romer Labs 公司的注册商标。 AflaStarMR 可以在 Shimadzu GLC Ltd.购买。 图3牛奶的预处理步骤 Milk Pretreatment Procedure *1如果是未经过均质化的原料奶，需要进行离心处理。有关详细内容请参考文献”。 *2有关免疫亲和柱的使用方法，请参考文献”的注解。 *3进行干燥时， AFM1 可能会吸附在容器上，建议您使用20~30%乙腈水溶液对经硅烷处理后干燥的容器进行清洗。 *4 对于注入 HPLC 的自动进样器用样品瓶，即使使用经硅烷处理的玻璃样品瓶，也可能吸附AFM1， 所以建议您使用树脂样品瓶。 ( 参考文献 ) ( 1)《关于牛奶中含有黄曲霉毒素M1的处理》(2015年7月23日，食安发0723第1号) ) ( 2)《关于牛奶中含有黄曲霉毒素M1的检测方法》》(2015年7月23日，食安发0723第5号) ) 按照下述的 Eqn. 1 计算得出的回收率为98%。由此可知，使用荧光检测器RF-20Axs 可对上限值1/10浓度的样品进行高灵敏度及高精度的分析。 另外，对于未添加 AFM1的牛奶，在AFM1的洗脱位置检测到极微小的峰。使用 LC/MS/MS 分析未添加 AFM1的牛奶，结果得出未添加AFM1的牛奶中具有 AFM1，其浓度低于规定上限值的1/100。 (添加AFMi的牛奶标准样品的峰面积)-(未添加AFM的牛奶标准样品的峰面积) 回收率[%]=-X100 AFMi标准样品的峰面积 Eqn.1 回收率计算公式 Percentage Recovery Equation 图4牛奶的HPLC 色谱图 (A) 添加了AFM1、(B)未添加AFM1 HPLC Chromatograms for Commercially Available Milk .(A) With added standard AFM1， (B) with no added standard AFM1 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 本文向您介绍根据方法①对市售牛奶进行分析的示例。使用岛津一体型HPLC Prominence-i和荧光检测器RF-20AXS，对牛奶中的AFM1进行分析。由结果可知，该方法对牛奶中AFM1 检测浓度为上述法规上限的1/10。