牛奶中氨基苷类多残留检测方案(液相色谱仪)

美国)LaballL中国独家代理天津市兰博实验仪器设备有限公司 农业部1025号公告-1-2008 牛奶中氨基苷类多残留检测——柱后衍生高效液相色谱法 1范围 本标准规定了牛奶中氨基苷类抗生素残留检测的制样和柱后衍生高效液相色谱测定方法。 本标准适用于牛奶中卡那霉素、安普霉素、新霉素、庆大霉素单个或多个残留鼍检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是沣日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修定版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682分析实验室用水规则和试验方法。 3制样 3.1 样品的制备 取适量新鲜或冷藏的空白或供试牛奶，使混合均匀。 3.2样品的保存 冷藏贮存备用，有效期1个月。 4测定方法 4.1 方法提要或原理 试料用磷酸缓冲液和lo%三氯乙酸溶液提取， G18SPE 柱净化，甲醇洗脱，氮气吹干，用水定容。高效液相色谱柱后衍生，荧光检测，外标法定量。 4.2试剂和材料 以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合 GB/T 6682规定的一级水。 4.2.1 庆大霉素硫酸盐标准品 (C19 H39 N507 H2SO4). 含量不得少于99.0%. 4.2.2安普霉素硫酸盐标准品 ( 电话：022-23592982 传真：022-2359298 7 ) (C21H41N5011.H2SO4)，含量不得少于98.0%。 4.2.3卡那霉素硫酸盐标准品 (C18H36N4 011.H2SO4)，)，含量不得少于98.0%。 4.2.4新霉素硫酸盐标准品 (C23 H46N6013-H2SO4)，含量不得少于99.0%。 4.2.5甲醇色谱纯。 4.2.6正己烷 4.2.7磷酸二氢钾优级纯。 4.2.8硼酸优级纯。 4.2.9硼酸钠优级纯。 4.2.10氢氧化钠优绒纯。 4.2.11氢氧化钾优级纯。 4.2.12氯化钾优级纯。 42.13氯化钠优级纯。 4.2.14三氯乙酸优级纯。 4.2.15邻苯二甲醛色谱纯。 4.2.16磷酸氢二钠优级纯。 4.2.17正己烷磺酸钠色谱纯。 4.2.182-巯基乙醇优级纯。 4.2.19磷酸二氢钠优级纯。 4.2.20乙酸优级纯。 电话：022-23592982 传真：022-23592987 4.2.21流动相A 称取尤水磷酸二氢钾13g，硼酸6.00g，加水溶解并稀释至1000 mL。 流动相B 称取氢氧化钾5.60g，加水溶解并稀释至1000 mL。 流动相C 称取氯化钾 75.00g，加水溶解并稀释至1000 ml. 4，2.22磷酸缓冲液 称取氯化钠8.50g，磷酸氢二钠3.58 g，磷酸二氢钠 3.12g，加水溶解并稀释至100rnL。4.2.23 100%三氯乙酸溶液(w/v) 称取三氯乙酸100g，加水溶解并稀释至100 ml，。 4.2.24 10%三氯乙酸溶液(w/v) 称取三氯乙酸 10.00 g，加水溶解并稀释至100 mL。 4.2.25正己烷磺酸钠溶液 称取正己烷磺酸钠0.49g，加水溶解并稀释至250mL。 4.2.26正己烷磺酸钠缓冲液 称取正已烷磺酸钠0.94g， 加水溶解，加乙酸0.5 mL， 用水稀释至250 mL。 4.2.27衍生化试剂 称取硼酸钠4.00g， 氢氧化钠I.00 g， 加水800mL溶解；称取邻苯二甲醛 100 mg，用甲醇10mL溶解，将邻苯二甲醛甲醇溶液加入硼酸钠缓冲溶液中，用水稀释至1000mL，加2一巯基乙醇2ml_，混匀，现配现用。 4.2.28标准贮备液 分别准确称取安普霉素、新霉素、卡那霉素和庆大霉素标准品适量，用水分别溶解并稀释制得含安普霉素、新霉素、忙那霉素和庆大霉素分别为IⅠ mg/mL的标准贮备液，4℃避光保存，有效期六个月。 4.2.29标准工作液 准确量取安普霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素标准贮备液适量，用磷酸缓冲液溶解并定容，制得卡那霉素、庆大霉素、新霉素和安普霉素浓度为100ug/L、200ug/L、500 ug/L、1000pg/L、2 000ug/L、5 000 ug/L、10 000ug/L的混合标准工作液，4℃避光保存，有效期一周。 4.3仪器和设备 4.3.1 高效液相色谱仪：配荧光检测器和柱后衍生系统。 4.3.2分析天平感量0.00001 g， 感量0.0001g，感量0.001g。 4.3.3离心机(5 000 r/min) 4.3.4冷冻高速离心机(10 000 r/min) 4.3.5电热恒温水浴锅 4.3，6旋涡混合器 4.3.7组织匀浆机 4.3.8C18SPE 柱(I00 mg/3mL) 4.4测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： -取混合均匀后的供试样品，作为供试试料。 -取混合均匀后的空白样品，作为空白试料。 ——取混合均匀后样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。 4.4.2提取 量取牛奶试料(5±0.05)ml. 置聚丙烯离心管中，加磷酸缓冲液5mL， 混匀，静置30 ( 传真：022-2359298 7 ) min，加10%三氯乙酸溶液5 mL， 混匀，静置10 min， 4 200 r/min 离心10min，取上清液至聚丙烯离心管中，加正己烷5mL，混匀，静置10 min， 弃正己烷层，加正己烷磺酸钠溶液2mL，混匀，备用。 4.4.3净化 固相萃取柱依次用甲醇、水、正己烷磺酸钠缓冲液各3ml_预洗，取备用渡过柱，依次用水、正己烷磺酸钠缓冲液各1mL淋洗，甲醇2mL洗脱，收集洗脱液，40℃水浴氮气吹干，用水10mL溶解，并转入1.5 rnl_聚丙烯离心管，10000 r / min 离心10 min， 驭上清液供高效液相色谱分析。 4.4.4标准曲线的备制 取标准丁作液，高教液相色谱检测，将测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。 4.4.5测定 4.4.5.1 液相色谱条件 a)色谱柱：阳离子交换柱(cation- exchange)4 mm×150 rnm 离子交换柱。 b)梯度洗脱程序： Time(min) A(%) B(%) C(%) 0 65 35 0 15 65 35 0 15.1 48 48 4 20 48 48 4 c)流速： 1mL/min d) 检测波长： Ex： 235 nrn， Em：465 nm C)进样量：50uI。 f)柱温：30℃ g)反应器温度：45℃ 电话：022-23592982 传真：022-23592987 h)衍生液流速：0.3mL/min 4.4.5.2液相色谱测定 取适量试样溶液和相应的标准溶液，做单点或多点校准，按外标法，以峰面积积分值定量，标准工作液及试样液中氨基苷类的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，在上述色谱条件下，标准溶液和试样的液相色蘑图见附录 A。 4.4.6空白实验 除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 4.5结果计算与表述 试料巾氨基苷类的残留量(ug/L)：按式(1)计算 式中： X-试料中氨基苷类残留量(ug/L)； A-试样溶液中氨基苷类的峰而积； As-标准工作液中氨基苷类的峰面积； cs-标准工作液中氨基苷类的浓度(ug/L)； V-溶解残余物所得试样溶液体积(mL)； M-样品体积(mL)。 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留至小数点后两位。 5检测方法灵敏度、准确度、精密度 5.1 灵敏度 ( 电话：022-23592982 传真：022-2359298 7 ) 本方法在牛奶中卡那霉素、安普霉素和庆大霉素检测限为 10ug/L，定量限为 20 ug/Io，新霉素的检测限为 25 pug/L， 定量限为100pg/L。 5.2准确度 本方法在牛奶中卡那霉素、庆大霉素和安普霉素添加浓度为 20 ug/L~100 ug/L的回收率为70.0%~110.00%新霉素添加浓度为100 ug/L-~1 000ug/L的回收率为80.0%-100.0%。 5.3精密度 本方法的批内变异系数 CV<15%.批间变异系数(CV<26%。 电话：022-23592982 传真：022-23592987 官网：www.tianjinlanbo.com邮箱： tianjinlanbo@vip.com 农业部1025号公告-1-2008牛奶中氨基苷类多残留检测——柱后衍生高效液相色谱法1范围    本标准规定了牛奶中氨基苷类抗生素残留检测的制样和柱后衍生高效液相色谱测定方法。    本标准适用于牛奶中卡那霉素、安普霉素、新霉素、庆大霉素单个或多个残留鼍检测。2规范性引用文件    下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是沣日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修定版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规则和试验方法。