水产及制品中磺胺5-甲氧嘧啶检测方案(柱后衍生装置)

天津市兰博实验仪器设备有限公司Lanbo Instrument Tianjin Co.， Ltd HPLC结合兰博柱后衍生系统测定水产品中14种磺胺类药物残留 磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，具有抗菌谱广、疗效强等优点，是目前水产养殖业中最常使用的抗生素之一，广泛用于鱼类的疖疮病、细菌性败血病、肠炎病、烂鳃病、弧菌病等。磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间较长，通过任何途径摄入的磺胺都有可能在人体内蓄积，容易产生排尿和造血紊乱等副作用。欧盟、美国、日本等国家对磺胺类药物在动物源性食品中的残留限量要求不断提高，许多磺胺类药物已经被列为禁用渔药，致使我国水产品出口在短时间内多次遭遇“技术壁垒” 为此需要快速、准确、廉价的多残留方法检测水产品中的磺胺类药物残留[1]。 磺胺类药物残留的检测方法主要有酶联免疫法[2]、、气相色谱法[3]、高效液相色谱法[4-6]、，气相色谱-质谱法[7]、高效液相色谱-串联质谱法[8-10]、毛细管电泳法[11]、生物免疫法[12]等。酶联免疫法和放射免疫法主要用于大规模的筛选工作，，一般不用于定量，容易出现假阳性；：气相色谱法用电子捕获检测器进行定量分析，具有较高的特异性，但该方法较为繁琐，不易操作；高效液相色谱紫外检测法和毛细管电泳法灵敏度低，特异性差，特别是在低浓度检测时样品基质干扰大，很难准确地定性确认；气相色谱-质谱法虽然灵敏度和特异性都很高，但衍生过程繁琐，带选择离子监控的高效液相色谱-串联质谱法克服了这些问题，但液质联用仪价格昂贵，不利于推广普及。本研究对水产品中磺胺类药物残留采用稀盐酸反萃取方法进行提取净化，在线柱后衍生荧光法进行检测，建立了一种同 ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 电 话：0 2 2-2359 2982 传 真：022-23592987 ) 时检测水产品中 14种磺胺类药物残留的分析方法。本方法准确、灵敏度高且操作简便，对14种磺胺类药物的定量检出限均低于20g/kg，能够满足农业行业标准[13]和欧盟委员会规定[14]中磺胺类总量 0.1mg/kg的限量要求。 仪器与设备 Lanbo Series4020 高效液相色谱仪(配荧光检测器和兰博PCR2柱后衍生装置)； IKAMS1旋涡混匀器，德国IKA公司； 高速离心机； AL204电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；N-EVAP 氮吹仪，美国 Organomation公司。 方法 1.1色谱条件 色谱柱： ODS-C18(250mm ×44.6mm， 5um)： 流动相：：乙腈、甲醇和2%乙酸溶液，梯度洗脱条件见表 1； 流动相流速 0.6mL/mi n、衍生试剂流速 0.1mL/min、柱温40℃、柱后反应器温度70℃、进样量50uL、荧光检测器激发波长405nm、发射波长495nm. ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 ) ( 电 传 真：0 2 2-2359 2 987 ) 表1流动相梯度条件 Table1 Gradient elution conditions 时间/min 0 15 30 45 45.1 55 乙腈/% 5 5 20 5 5 甲醇/% 10 10 10 10 10 2%乙酸溶液/% 85 85 70 85 85 1.2样品处理 称取 10.00g 样品置于 50mL 离心管中，加入磺胺吡啶内标使用液250uL，然后加入乙酸乙酯30mL，均质机14000r/min 均质 1min， 振动2min， 3000r/min 离心10min， 将乙酸乙酯层小心转移到100mL 梨形瓶中。再向原离心管中加入乙酸乙酯20mL，旋涡混匀30s，振动 2min，3000 r/min 离心 10min， 将乙酸乙酯层小心转移到原i1100mL梨形瓶中，40℃减压浓缩至约1mL。然后将梨形瓶中的溶液转移至15mL刻度离心管， 再用 4mL乙酸乙酯分两次清洗梨形瓶，溶液合并至15mL刻度离心管。在离心管中加入 2.00mL2mol/L盐酸溶液，旋涡混匀 1min，加盖后振动2min， 3000r/min 离心 8min， 移去乙酸乙酯层，在余液中加入正己烷5mL，旋涡混匀30s， 3000r /min 离心 8min，移去正己烷层，0.45um微孔滤膜过滤。取200 jL滤液、200p L 乙酸钠溶液、50uu L乙腈和50uL甲醇加入到试样瓶中，旋涡混匀 1min，样品用高效液相色谱柱后衍生荧光检测。 1.3加标回收率实验 加标回收率实验所用样品为南美白对虾。磺胺的添加量为2.5、10、 ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 ) ( 话：022-23592982 ) ( 真：0 2 2-2359 2 987 ) 2 5 gu/kg和50u1g/kg，磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的添加量为5.0、20、50gg/kg 和100i g/kg，磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺喹噁啉的添加量为10、40、100m g/kg和200u g/kg， 每个添加水平进行6次重复实验，计算回收率和相对标准偏差。 1.4在线柱后衍生化 荧光胺是荧光试剂，对初级脂肪族胺和芳香族胺具有特异性，与磺胺类药物结合后产生高荧光效应和选择性的荧光体，具有激发-发射光谱特性( ex = 395~405nm 和X入ex = 490~510nm)，荧光胺及其水解产物则没有荧光性。荧光胺与磺胺类药物的反应如图1所示。利用这一特性，本研究采用磺胺类药物经荧光胺在线柱后衍生荧光检测，缩短了分析时间，避免了样品处理中过多的净化步骤，消除了基质干扰。 图1磺胺类药物衍生化反应式 Fig.1 IDerivatization reaction of sulfonamide ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 ) 电话：022-23592982 传 真：022-2359 2987 1.磺胺；2.磺胺嘧啶；3.磺胺噻唑；4.磺胺吡啶(内标)；5.磺胺甲基嘧啶；6.磺胺-5-甲氧嘧啶；7.磺胺二甲基嘧啶；8.磺胺甲氧哒嗪；9.磺胺氯哒嗪；10.磺胺6-甲氧嘧啶；11.磺胺甲基异噁唑；12.磺胺多辛；13.磺胺异噁唑；14.磺胺二甲氧哒嗪；15.磺胺喹噁啉。 图214种磺胺类药物的色谱图 Fig.2HPLC separation profile for 14 sulfonamides 结 论 建立水产品中14种磺胺类药物的高效液相色谱-柱后衍生荧光检测法测定测定方法。本方法采用盐酸溶液反萃取提高了净化效果；优化的色谱条件可将14种磺胺类药物完全分离；采用柱后衍生实现了在线检测，缩短了分析时间，提高了方法灵敏度。本方法具有重现性好、精密度高、杂质干扰少等优点，广泛适用于水产品中磺胺类药物残留的检测。 ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 ) ( 电 传 真：0 2 2-2359 2 987 ) 表2 14种磺胺的线性范围、线性方程、相关系数和定量检出限 Table 221Linear ranges， regression equations， correlation coefficientsand limits of quantitation for 14 sulfonamides 磺胺类 线性范 相关定量检出限/ 药物 围/(ug/L) 线性方程 系数 (ug/kg) 磺胺 2.5~100 y=1.7589x 0.9999 磺胺嘧啶 5.0~~200 v=0.84115x 1.0000 磺胺噻唑 5.0~200 y=1.0053x 0.9999 磺胺甲基嘧啶 5.0~200 y=1.1160x 1.0000 磺胺5-甲氧嘧啶 10~400 v=0.82673x 0.9996 磺胺二甲基嘧啶 5.0~200 y=0.70654x 0.9934 磺胺甲氧哒嗪 10~400 v=0.50376x 1.0000 10 磺胺氯哒嗪 10~400 v=0.27538x 1.0000 10 磺胺6-甲氧嘧啶 10~400 v=0.58109x 0.9998 10 磺胺甲基异恶唑 10~400 v=0.26488x 0.9999 10 磺胺多辛 10~~400 y=0.43025x 0.9999 10 磺胺异恶唑 10~400 y=0.18308x 0.9998 10 磺胺二甲氧哒嗪 10~~400 v=0.24444x 0.9999 10 磺胺喹噁啉 20~800 v=3.2998 ×102x 0.9999 20 ( 公司地址：天津市华苑新技术产业园区榕苑路4号天发科技园7号楼1门2层8层 ) -电话：022-23592982 传 真：022-23592987 话：