蛋白，药物-蛋白中绝对分子量，分子尺寸检测方案(凝胶色谱仪)

UHPLC 与uDAWN， UT-rEX联用测定绝对分子量 Sophia Kenrick，Ph.D and Aym Berges，Ph.D 尺寸排阻色谱(SEC)被广泛用于表征生物大分子样品中，聚集体或片段的尺寸和组成。传统 SEC 要借助标样校正色谱柱，得到洗脱时间与分子量的标准曲线。但是，这些标样常常与待测样品的构象相差甚远，或者待测样与色谱柱填料之间有相互作用，这都会改变样品的洗脱性质(相较于标标)。SEC 与光散射检测器联用，如 miniDAWNTREOS， 无需考虑洗脱时间，可测定样品的绝对分子量。 超高效液相(UHPLC)可快速、有效的分离生物大分子样品。与标准 SEC 相比，UHP-SEC 的分辨率更高、工作效率更高、溶剂消耗和样品消耗更少，这对于珍贵的生物样品来讲是非常重要的。但事实证明，为标准 HPLC 设计的检测器并不适用于UHPLC 这一先进技术。美国怀雅特技术公司的 u DAWN多角度激光光散射检测器(MALS)和 Optilab UT-rEX 折光检测器，专门为了 UHPLC 而设计，三者联用可测定UHPLC 系统中样品的绝对分子量(或者摩尔质量)以及尺寸大小。 对于一个给定的蛋白，，一次完整的UHPLC 分析可在 5min 内完成(图1，红色曲线)，而传统的 HPLC，，一个样品将花费20min 或者更长的时间。两种情况下，均使用了激光光散射仪和示差检测器，测定每一个样品峰的摩尔质量。图1是标准的SEC-MALS 系统和 UHPLC-SEC-MALS系统测得的单体，二聚，以及多聚体的摩尔质量以及色谱信号的叠加图，其中 SEC-MALS 系 图1UHPLC分离一种蛋白得到的光散射数据以及分子量分布图(红色)，与标准 HPLC 分离后得到的谱图(蓝色)叠加， UHPLC 检测中使用的是uDAWN 和Optilab UT-rEX， 标准 HPLC检测使用的是 miniDAWNTREOS 和 Optilab T-rEX。上面的谱图是洗脱时间的函数，而下面的谱图是柱体积的函数。 统使用的是 miniDAWN TREOS，Optilab T-rEX，而UHPLC-SEC-MALS 系统使用的是uDAWN和 Optilab UT-rEX。为了更容易比较，将图1上中的色谱图转化为分子量与柱体积的关系图(图1下)。每一个样品峰对应的摩尔质量高度一致，这意味着可直接将现有的HPLC方法转变成 UHPLC 方法，并保证得到同样准确，高质量的分子量数据。 除了更快的分析时间， UHPLC 较小的固定相粒径，有助于提高聚集体和片段的分辨率，标准色谱柱和检测器内部的体积较大，引起色谱峰扩散而导致峰展宽，这会使某一分辨率较低的样品峰消失，例如图2所示的片段(蓝线)。uDAWN最大程度上减小了系统的内部体积，确保 UHPLC 洗脱图谱的高分辨率，有助于我们检测和分析以前未知的样品。 图2底部的图谱中(红色)，样品从 UV进入uDAWN 和 Optilab UT-rEX， 碎片峰被保留 以便计算片段的分子量。因为所有蛋白的折光指数增量(dn/dc)几乎是恒定的，可根据该参数计算出样品的浓度和摩尔质量，而不必知道样品峰的紫外消光系数。事实上， UV和RI检测器联用，可以测定每一个样品峰的紫外消光系数并有助于鉴别它们。 uDAWN不仅可测定样品的绝对分子量，也可与 UHPLC 联用实现所有深度分析。与标准 HPLC-MALS一样，可根据整个UHPLC-MALS样品峰的分子量分布定量计算生物大分子的多分散度或者判断蛋白寡聚物是否可逆。三检测器UV， MALS 和RI联用，可进行蛋白复合物分析，确定翻译后修饰蛋白，与洗涤剂复合蛋白，药物-蛋白复合物的数目或者其他多肽附加物的信息。 动态光散射可选组件 WYATT QELS模块可在进行 MALS 测试的同时，测定样品的流体力学半径，三角度的 miniDAWN 检测器的 rms 测定范围是10-50nm，这点uDAWN与其是一致的。这一套完整的检测器意味着，我们可以充分利用 UHPLC 的高效率而不必牺牲数据质量，且可与 MALS 联用测定样品的绝对分子量。 80 巴一盖o 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 图2： UHPLC分离一种蛋白得到的光散射数据以及分子量分布图(红色)，与标准 HPLC分离后得到的谱图(蓝色)叠加。方框中的谱图表明仅 UHPLC 可分离出碎片峰，下图显示的是放大之后的碎片峰信号以及对应的分子量分布，使用的检测器是uDAWN。 Methods： UHPLC 系统使用的是Waters公司的超高压液相色谱泵，自动进样器，紫外检测器， wyatt technologycorporation的uDAWN和UT-rEX。 分离使用的是Waters BEH200 液相色谱柱：图1柱子规格是4.6×150mm， 图2柱子规格是 4.6×300mm。所用样品均为牛血清白蛋白 (Sigma)。