自动样品前处理液质联用法监测氨基糖苷类抗生素及万古霉素的血浆药物浓度

本文建立了一种快速自动化的方法来检测氨基糖苷类抗生素和万古霉素，应用于治疗药物的监测。 方法性能足以确保常规准确定量。 样品制备的自动化还极大地提高了实验室的通量和易用性。SSL-CA23-142Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-770 自动样品前处理液质联用法监测氨基糖苷 类抗生素及万古霉素的血浆药物浓度 LCMSMS-770 摘要：本文利用CLAM-2030 自动样品处理仪串联超高效液相色谱三重四极杆质谱系统，建立了人血浆中7种氨基糖苷类抗生素和万 古 霉素的自动化高通量检 测 方法。血浆样品经 CLAM-2030 蛋白沉淀，离心过滤后 ，即可自动转移至 LC-MS/MS 进行数据采集。经基质效应、提取回收率 、线性、精密度及准确度等方法学评价，结果显示该方案快速、稳定、可靠，可以替代繁琐的人工操作，提高检测效率 。 关键词： CLAM-2030自动样品前处理治疗药物监测 氨基糖苷类 抗 生素 氨基糖苷类抗生素常用于治疗 严 重感染，特别是 革兰氏阴性杆菌感染。氨基糖苷类由于其肾毒性而且 治疗窗窄，需要进行治疗药物监测，以保证合理安全 用药。氨基糖苷类药物监测(TDM)的益处已得到公认。万古霉素是一种糖肽类抗生素，由于它们的协同作用，经 常 与氨基糖苷类一起使用，它也具有 肾毒 性，也需 要进行监测 。 虽然 LC-MS/MS 现在被认为是 TDM的金标准方 法，但许多 临 床实验室仍在使用免疫测定法 。免疫测 定具有交叉反应性，特异性差，效率低 下 且检 测 成本高。基于以上原因，开发一种高灵敏、高特异 、高通量的 药物浓度监测方法具有重要的现实意义。 本文建立了一种 CLAM-2030 全自动样品处理仪与 亲水相互作用液相色谱(HILIC) 三重四极杆质谱 联 用的 高通量检 测 方法， 可实现自动样品处理及检测，2可同 时分析7种氨基糖苷类和万古霉素。 1.1仪器 CLAM-2030 串联超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪(图1)，具体配置为 输 液 泵 LC-30A 系统控制器： CBM-20A 自动进样器 号： SIL -30AC 质谱检测器 ： LCMS-8060柱 温品 箱：：CTO-30A 自动样品处理仪：CLAM-2030 色谱 工 作站： LabSo l utions Ver. 5.91 图1 CLAM-2030 串联超 高 效液相色谱 三 重四极杆质谱联用仪 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱 柱：InertSustain Amide (50 mm×2.1 mm l.D.， 3 um)， GL Sciences，货号：5020-88727流动 流 相：A相-1%甲酸水+250mM甲酸铵；B相-乙腈 速：0.4mL/min 进样体积：0.5uL 柱 温 50℃ 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为75%，洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.20 Pumps B.Conc 75 1.30 Pumps B.Conc 55 2.80 Pumps B.Conc 55 2.90 Pumps B.Conc 75 4.75 Controller Stop 质谱条件 离子 頭 ：源：EESI(+) 加热模块温度：300℃ 雾 化气流速：2.5L/min DL 温 度：150°℃ 加热气流速：110.0 L/min 接 口 /温 度：500℃ 干燥气流速：3.0 L/min 扫 描 模 式： MRM 表2 化合物 MRM 离 子 对 # 化合物 英文名 CAS 号 定量离子对 定性离子对 1 阿米卡星 Amikacin 37517-28-5 586.3>163.3 586.3>425.2 2 阿贝卡星 Arbekacin 51025-85-5 553.4>163.1 553.4>425.3 3 庆大霉素 Cla Gentamicin Cla 26098-04-4 450.4>322.1 450.4>163.1 4 庆大霉素 C1 Gentamicin C1 25876-10-2 478.4>322.2 478.4>157.1 5 庆大霉素 C2 Gentamicin C2 25876-11-3 464.4>322.1 464.4>160.1 6 潮霉素B(内标) Hygromycin B 31282-04-9 528.3>352.1 528.3>256.9 7 卡那霉素 Kanamycin 8063-07-8 485.4>163.1 485.4>324.0 8 新霉素B Neomycin B 119-04-0 615.4>163.1 615.4>163.0 9 巴龙霉素 Paromomycin 7542-37-2 616.4>293.1 616.4>163.1 10 妥布霉素 Tobramycin 32986-56-4 468.3>324.1 468.3>163.1 11 万古霉素 Vancomycin 1404-90-6 725.4>1307.2 725.4>144.4 1.3样品前处理 使用 CLAM-2030 自动样品前处理仪，以相同的方法处理校准品、QC及样品。20微升水/异丙醇(1：3)活化 过滤器，并加入100微升沉淀剂(三氯乙酸100 g/L 水溶液)。然后加入20uL内标(水中50 ug/mL 的潮霉 素 B)和 20 uL血浆。涡旋1分钟后，在90秒内过滤沉淀物，并将提取物转移至自动进样器进样分析。样品制备过程 建议 与 分析检 测 重叠可增加样品通量。 结果与讨论 2.1线性关系 使用具有 1/x 或 1/x²加权的二次回归模型通过内标法计算校准曲线。准确度需在85%-115%之间。典型 的校准曲线如图2所示， LLOQ的色谱图如图3所示。 图 2 典型的校准曲线 Q478.40>322.15(+) 1.41e4 图3 LLOQ 色谱图 2.2回 收率结果 通过比较血浆 QC 的 峰面积 与 溶液 QC 峰 面积来评估总回收率(即萃取和基质效应)。每种类型的样品制备 一式三份。结果如表3所示。平均回收率在89%-105%之间，说明萃取率高且基质效应低。 表3 回收率结果 (n=3) 化合物 血浆 QC 溶剂 QC %回收率 平均峰面积 %RSD 平均峰面积 %RSD 阿米卡星 10113056 9% 10759507 2% 94% 庆大霉素 Cla 3527104 2% 3525507 4% 100% 庆大霉素 C1 43678905 0.30% 44889021 9% 97% 庆大霉素 C2 8757317 9% 8725000 4% 100% 卡那霉素 9596851 7% 10020195 1% 96% 巴龙霉素 2588488 12% 2735816 0% 95% 妥布霉素 20326679 10% 18901937 1% 108% 万古霉素 3188732 0.40% 3573458 1% 89% 新霉素B 2505853 8% 2382767 9% 105% 潮霉素B 6872652 2% 7641951 1% 90% 2.3精密度 与 准确性 连续3天检测四个浓度水平的 QC样品(重 复5次进样)来评估精密度和准确度。评价标准是相对标准偏差 <15%(LOQ为20%)，准确度在80-120%之间。结果见表4。 表 4 精密度及准确性结果 阿米卡星 庆大霉素Cla 庆大霉素 C1 庆大霉素 C2 卡那霉素 平均浓度(ug/mL) 0.0984 0.0980 0.0968 0.0996 0.1080 QC LOQ %RSD 6.10% 10.40% 6.30% 9.50% 8.10% 理论浓度(ug/mL) 0.1010 0.1010 0.1010 0.1010 0.1000 准确度 97.40% 97.00% 95.80% 98.60% 108.00% 平均浓度(ug/mL) 0.2830 0.3030 0.2690 0.3080 0.2730 QCA(低) %RSD 2.50% 3.90% 5.40% 1.90% 2.10% 理论浓度 (ug/mL) 0.3020 0.3020 0.3020 0.3020 0.3000 准确度 93.60% 100.00% 89.20% 102.00% 91.00% 平均浓度(ug/mL) 27.8 25.3 25.7 26.9 26.9 QCB(中) %RSD 3.30% 3.80% 1.00% 2.80% 2.50% 理论浓度(ug/mL) 25.0 24.9 24.9 24.9 24.8 准确度 111.00% 102.00% 103.00% 108.00% 108.00% 平均浓度(ug/mL) 44.5 43.8 44.8 46.4 45.6 QCC(高) %RSD 1.80% 3.20% 1.30% 3.00% 1.20% 理论浓度(ug/mL) 42.7 42.6 42.6 42.6 42.4 准确度 104.00% 103.00% 105.00% 109.00% 107.00% 阿米卡星 庆大霉素 Cla 庆大霉素 C1 庆大霉素 C2 卡那霉素 平均浓度(ug/mL) 0.1100 0.1140 0.1020 0.1050 0.0998 QC LOQ %RSD 13.80% 13.80% 6.30% 10.30% 11.10% 理论浓度(ug/mL) 0.1000 0.1000 0.1000 0.1000 0.0990 准确度 110.00% 114.00% 102.00% 105.00% 101.00% 平均浓度(ug/mL) 0.2760 0.2780 0.3230 0.2770 0.2690 QCA(低) %RSD 10.30% 3.20% 6.00% 7.10% 4.10% 理论浓度(ug/mL) 0.3000 0.3010 0.3000 0.3010 0.3000 准确度 92.10% 92.30% 108.00% 92.00% 89.50% QCB(中) 平均浓度(ug/mL) 27.8 26.8 51.8 27.4 16.0 %RSD 3.80% 2.50% 4.70% 4.90% 3.10% 理论浓度(ug/mL) 24.8 24.9 49.6 24.9 15.0 准确度 112.00% 108.00% 104.00% 110.00% 106.00% QCC(高) 平均浓度(ug/mL) 43.4 45.5 90.4 40.3 26.5 %RSD 1.00% 1.20% 2.10% 3.60% 1.00% 理论浓度(ug/mL) 42.4 42.6 84.9 84.9 25.2 准确度 102.00% 107.00% 106.00% 47.50% 105.00% ■结论 本文建立了一种快速自动化的方法来检 测 氨基糖苷类抗生素和万 古 霉素，应用于治疗药物的监测。方法性能 足以确保 常 规准确定量。样品制备的自动化还极大地提高了实验室 的 通量和易用性。 岛津应用云