恒温振荡培养箱在食品中肌醇的测定-微生物法中的作用

恒温振荡培养箱在食品中肌醇的测定-微生物法中的作用（根据中华人民共和国国家标准GB 5009.270-2016）一、 原理利用葡萄汁酵母菌对肌醇的特异性和灵敏性，定量测定试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的培养基中，微生物的生长与待测物质含量呈线性关系。根据透光率与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中待测物质的含量。二、使用试剂1. 氯化钠2. 氢氧化钠3. 盐酸4. 五氧化二磷5. 葡萄汁酵母菌三、试剂配制1. 氯化钠溶液（9g/L）：称取9.0g氯化钠溶解于1000ml，水中、分装试管，每管10ml。12℃灭菌15min。2. 盐酸溶液（1mol/L）:量取82ml盐酸，冷却后定容至1000ml。3. 盐酸溶液（0.44mol/L）：量取36.6ml盐酸，冷却后定容至1000ml。4. 氢氧化钠溶液（600g/L）:称取300g氢氧化钠溶解于水中，冷却后定容至500ml。5. 氢氧化钠溶液(1mol/L)：称取40g氢氧化钠溶解于水中，冷却后定容至1000ml。四、 使用仪器1. 培养基2. 玻璃珠 直径约5mm3. 天平：感量为0.1mg4. pH计：精度±0.015. 分光光度计6. 涡旋振荡器7. 离心机：转速≥2000r/min8. 恒温培养箱：30℃±1℃，振荡速度140次/min~160次/min9. 振荡培养箱:30℃ ±1℃，振荡速度140次/min~160次/min10. 压力蒸汽消毒器：121℃（0.10Mpa~0.12Mpa）五、分析步骤1. 接种菌悬液的制备（1） 菌种复苏 将菌株活化后接种到浸粉琼脂斜面培养基上，30℃±1℃培养16h~24h后，再转接2~3代来增强活力，制成储备菌种，贮于4℃冰箱中，保存期不要超过2周。临用前接种到新的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上。（2） 接种菌悬液的制备 A.在使用前一天将贮备菌种转接到新配制的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上，于30℃±1℃培养20h~24h。接种环刮取菌苔到装有氯化钠溶液（9g/L）的试管中。以2000r/min离心15min，如此清洗3~4次。吸取一定量的该菌液移入装有10ml氯化钠溶液（9g/L）的试管中，制成接种菌悬液。B. 用分光光度计，以氯化钠溶液作空白，550nm波长下测定该接种菌悬液的透光率，调整加入的菌液量或加入一定量的氯化钠溶液使该菌悬液透光率在60%~80%。2. 试样制备谷物类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3mm~0.5mm）；肉及肉制品等用打碎机制成食糜；果蔬等试样需匀浆混匀。3. 试样提取准确称取肌醇0.5~2.0mg的试样，一般乳粉、新鲜果蔬、内脏、生肉试样1g；谷类、豆类、含量较低的天然食品试样5g，一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1g~0.5g；液体饮料或流质、半流质试样5g~10g于250ml锥形瓶中，对于干粉试样加入80ml盐酸溶液（0.44mol/L）,对于液体试样加入100ml盐酸溶液（0.44mol/L），混匀。将锥形瓶以铝箔纸覆盖，在灭菌釜中125℃水解1h。取出，冷却至室温，加入约2ml氢氧化钠溶液（600g/L）,冷却。用氢氧化钠溶液（1mol/L）或盐酸溶液（1mol/L）调pH至5.2转入250ml容量瓶中，定容至刻度。混匀，过滤，收集滤液，该滤液为待测液。调整稀释度，使待测液肌醇的浓度在1ug/ml~10ug/ml范围内。4. 标准曲线的制作 按顺序加入水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基于培养管中一式三份。5.待测液的制作 加入水、待测液和肌醇测定培养基于培养管中，一式三份。                                     6.灭菌 每支试管中加入一粒玻璃珠，盖上试管帽，121℃灭菌5min7.接种 将试管固定在WIGGENS WS-600系列恒温振荡培养箱内，用140~160次/min的振荡速度，在30±1℃振荡培养22~24。8.测定（1）从振荡培养箱内取出试管，放入灭菌釜内，100℃保持5min，使微生物停止生长。（2）用接种空白试管S1做空白，将分光光度计透光率调到100%，读出接种空白试管S2的读数。再以接种空白试管S2作空白，调节透光率为100%，依次读出其他每支试管的透光率。（3）用WIGGENS Vortex 3000 Elite涡旋振荡器充分混合每一支试管后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长540nm~660nm，待读数稳定30s后，读出透光率，每支试管稳定时间要相同。以肌醇标准系列的浓度为横坐标，透光率为纵坐标作标准曲线。（4）根据待测液的透光率，由标准曲线中得到该待测液中肌醇的浓度，再根据稀释因子和称样量计算出试样中肌醇的含量。透光率超出标黄尊曲线管S3~S10范围的试样管舍去。（5）对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率计算每毫升该编号待测液肌醇的浓度，并计算该编号待测液的肌醇浓度平均值，每支试管测得的浓度不超过其平均值的±15%，超过者要舍去。六、计算结果    七、注意事项1.玻璃仪器使用前，用活性剂（月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可）对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后200℃干热2h。2.试样制备时，液体试样用前应振摇混匀，4℃冰箱保存，1周内测定。3.测定时，应对每支试管进行视觉检查，接种空白试管S1内培养液应该是澄清的，如果出现浑浊，则结果无效。4.测定结束后，如果有1管的测定结果不符合上述要求，则舍去该管的测定结果，重新计算平均值；如果有2管的测定结果不符合上述要求，则重新检验。参考标题：1.振荡培养箱在食品中肌醇的测定-微生物法中的作用2. 恒温培养箱在食品中肌醇的测定-微生物法中的作用3. 台式离心机在食品中肌醇的测定-微生物法中的作用4. 涡旋振荡器在食品中肌醇的测定-微生物法中的作用5. pH 计在食品中肌醇的测定-微生物法中的作用恒温振荡培养箱在食品中肌醇的测定-微生物法中的作用 (根据中华人民共和国国家标准GB 5009.270-2016) 一、原理 利用葡萄汁酵母菌对肌醇的特异性和灵敏性，定量测定试样中待测物质的含量。在含有除待 测物质以外所有营养成分的培养基中，微生物的生长与待测物质含量呈线性关系。根据透光 率与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中待测物质的含量。 二、使用试剂 1.氯化钠 2.氢氧化钠 3.盐酸 4.五氧化二磷 5.葡萄汁酵母菌 三、试剂配制 1.氯化钠溶液 (9g/L)：称取9.0g氯化钠溶解于1000ml ， 水中、分装试管，每管10ml。12℃灭菌 15min。 2.盐酸溶液 (1mol/L) ：量取 82ml盐酸，冷却后定容至1000ml。 3.盐酸溶液 (0.44mol/L)：量取 36.6ml盐酸，冷却后定容至1000ml。 4.氢氧化钠溶液 (600g/L) ：称取 300g 氢氧化钠溶解于水中，冷却后定容至 500ml。 5. 氢氧化钠溶液(1mol/L)：称取40g 氢氧化钠溶解于水中，冷却后定容至1000ml。 四、使用仪器 1.培养基 2.玻璃珠直径约5mm 3.天平：感量为 0.1mg 4. pH计：精度±0.01 5.分光光度计 6.涡旋振荡器 7.离心机：转速≥2000r/min 8.恒温培养箱：30℃±1℃，振荡速度140次/min~160 次/min 9.振荡培养箱：30℃±1℃，振荡速度 140 次/min~160 次/min 10.压力蒸汽消毒器：121℃(0.10Mpa~0.12Mpa) ChemTron PH610专家型台式 pH计 WIGGENS Vortex 3000 Elite 涡旋振荡器 WIGGENS BIOCEN 22R 微量台式离心机 WIGGENS WH-650 恒温培养箱 WIGGENS WS-600 系列恒温振荡培养箱 五、分析步骤 1.接种菌悬液的制备 (1)菌种复苏将菌株活化后接种到浸粉琼脂斜面培养基上，30℃±1℃培养 16h~24h 后，再转接2~3代来增强活力，制成储备菌种，贮于4℃冰箱中，保存期不要超过2周。临用 前接种到新的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上。 (2)接种菌悬液的制备 A.在使用前一天将贮备菌种转接到新配制的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上，于30℃±1℃培养 20h~24h。接种环刮取菌苔到装有氯化钠溶液(9g/L)的 管中。以2000r/min离心15min，如此清洗3~4次。吸取一定量的该菌液移入装有 10ml氯化钠溶液 (9g/L)的试管中，制 成接种菌悬液。 B. 用分光光度计，以氯化钠溶液作空白， 550nm 波长下测定该接种菌悬液的透光率，调整 加入的菌液量或加入一定量的氯化钠溶液使该菌悬液透光率在60%~80%。 2.试样制备 谷物类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm)；肉及肉制品等用 打碎机制成食糜；果蔬等试样需匀浆混匀。 3.试样提取 准确称取肌醇0.5~2.0mg的试样，一般乳粉、新鲜果蔬、内脏、生肉试样1g；谷类、豆 类、含量较低的天然食品试样5g，一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1g~0.5g；液体 饮料或流质、半流质试样5g~10g于250ml锥形瓶中，对于干粉试样加入80ml 盐酸溶液 (0.44mol/L) ，对于液体试样加入100ml盐酸溶液 (0.44mol/L)， 混匀。 将锥形瓶以铝箔纸覆盖，在灭菌釜中125℃水解 1h。取出， 冷却至室温，加入约 2ml氢氧 化钠溶液 (600g/L)，冷却。用氢氧化钠溶液 (1mol/L)或盐酸溶液 (1mol/L) 调pH至 5.2转入250ml容量瓶中，定容至刻度。混匀，过滤，收集滤液，该滤液为待测液。调整 稀释度，使待测液肌醇的浓度在 1ug/ml~10ug/ml范围内。 4.标准曲线的制作按顺序加入水、肌醇标准工作液和肌醇测定培养基于培养管中一式三份。 表1 标准曲线的制作 试管号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 水/mL 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 肌醇标准工作液(1pg/mL)/mL 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 肌醇标准工作液(2ug/mL)/mL 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 培养基/mL 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5.待测液的制作加入水、待测液和肌醇测定培养基于培养管中，一式三份。 表2待测液的制作 试管号 1 2 3 4 水/mL 4 3 2 1 试样提取液/mL 1 2 3 4 培养基/mL 5 5 5 5 6.灭菌每支试管中加入一粒玻璃珠，盖上试管帽，121℃灭菌 5min 7.接种将试管固定在 WIGGENS WS-600 系列恒温振荡培养箱内，用140~160 次/min的 振荡速度，在30±1℃振荡培养22~24。 8.测定 (1)从振荡培养箱内取出试管，放入灭菌釜内，100℃保持5min， 使微生物停止生长。 (2)用接种空白试管S1做空白，将分光光度计透光率调到100%，读出接种空白试管 S2 的读数。再以接种空白试管S2 作空白，调节透光率为 100%， 依次读出其他每支试管的透 光率。 (3)用 WIGGENS Vortex 3000 Elite 涡旋振荡器充分混合每一支试管后，立即将培养液 移入比色皿内进行测定，波长540nm~660nm， 待读数稳定 30s后，读出透光率，每支试 管稳定时间要相同。以肌醇标准系列的浓度为横坐标，透光率为纵坐标作标准曲线。 (4)根据待测液的透光率，由标准曲线中得到该待测液中肌醇的浓度，再根据稀释因子和 称样量计算出试样中肌醇的含量。透光率超出标黄尊曲线管 S3~S10范围的试样管舍去。 (5)对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率计算每毫升该编号待测液肌醇的浓 度，并计算该编号待测液的肌醇浓度平均值，每支试管测得的浓度不超过其平均值的±15%，超过者要舍去。 六、计算结果 试样 中 肌醇的含量按式(1)计 算： 式中 ： X ——试样中肌醇的含量，单 位为毫克每百克(mg /100 g)； C， —5.8.5中计算所得的平均值 ，单位为微克(ug)； ——样品质量 ，单位为克(g )； ——样液稀释倍数； 10000一 ——换算系数； 100 ——换算系数。 计算结果保留 三 位有效数字 。 七、注意事项 1.玻璃仪器使用前，用活性剂(月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可)对硬玻璃 测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后200℃干热2h。 2.试样制备时，液体试样用前应振摇混匀，4℃冰箱保存，1周内测定。 3.测定时，应对每支试管进行视觉检查，接种空白试管S1 内培养液应该是澄清的，如果出 现浑浊，则结果无效。 4.测定结束后，如果有1管的测定结果不符合上述要求，则舍去该管的测定结果，重新计算 平均值；如果有2管的测定结果不符合上述要求，则重新检验。