植物源性食品中有机酸含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-255Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-675 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 法测定植物源性食品中有机酸的含量 LCMSMS-675 摘要：本文利用岛津三重四极杆液质联用仪，建立了植物源性食品中14种有机酸物质含量的分析检测方法。该方法可以将目标物与其他杂质组分的色谱峰实色良好的分离；在0.1~5.0 ug/mL 的浓度范围内建立标准曲线，线性关系良好；植物源性样品的综合加标回收率在 83.4%~103.8%之间；14种有机酸物质的 LOD 为0.0003~0.010 ug/mL， LOQ为0.001~0.033 ug/mL， 均满足 GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法》标准的要求。该方法具备操作简捷、灵敏度高、分析速度快，可以满足多种植物源性样品中有机酸物质的定性定量分析。 关键词：三重四极杆液质联用仪植物 有机酸 有机酸 (Organic acids) 是指分子结构中含有羧基(一COOH) 的化合物。在植物的茎、叶、根、特别是果实中广泛分布。常见的植物中的有机酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸，如：酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸等；亦有芳香族的有机酸，如：苯甲酸、水杨酸、咖啡酸等。有报告认为，有机酸除具有抗生素作用外，还具有着广泛的生物活性，如：苹果酸、枸椽酸、酒石酸、抗坏血酸等有机酸就可作用于中枢神经系统。还有些特殊种类的有机酸是某些中草药的有效成分，如：土槿皮酸有抗真菌作用，咖啡酸有生物活性，绿原酸有抗菌、利胆、降血压、降血脂和升高白血球等作用。 现代科学对有机酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。 随着各行各业对有机酸类物质的逐渐关注，2021年5月21日，由国家市场监督管理总局与国家标准化管理委员会联合发布了植物中有机酸含量的检测方法，并在2021年12月1日实施执行，其中规定了采用高效液相色谱串联质谱法对多种植物中的14种有机酸类物质的含量进行分析测定。 本文采用岛津三重四极杆液质联用仪，参照 GB/T40179-2021《植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法》，建立了植物中14种有机酸物质的含量测定方法。该方法快速准确、灵敏度高，适用于植物源性食品中的14种有机酸类物质的快速筛查及准确测定。 1.1仪器配置 岛津LCMS-8045 三重四极杆液质谱联用系统。具体配置为： 系统控制器： CBM-20A脱气机： DGU-20A5R输液泵： LC-30AD×2自动进样器： SIL-30AC柱温箱：CTO-20AC检测器： LCMS-8045 色谱工作站： LabSolutions Ver.5.99 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack GIST-HP C18-AQ 色谱柱(2.1mml.D.×100 mmL，3um，岛津(上海)实验器材有限公司 P/N：227-30765-03) 流动相：A相0.1%甲酸水溶液，B相甲醇流速：0.2 mL/min 进样量：2uL柱温：35℃ 洗脱方式：梯度洗脱初始浓度：A相初始浓度为95%，B相初始浓度为5%，详见表1 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 泵 B.Conc 5 15 泵 B.Conc 60 20 泵 B.Conc 95 23 泵 B.Conc 95 23.1 泵 B.Conc 5 28 控制器 Stop 质谱条件： 离子源： ESI(-) 接口电压：-4.5kV雾化气流速：3L/min加热模块温度：400℃加热气流速：10.0L/minDL 温度：250℃接口温度：300C干燥气流速：10.0 L/min扫描模式：多反应监测(MRM)MRM 参数：详见表 2 表2 有机酸物质 MRM 参数 序号 化合物名称 CAS# 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 富马酸 110-17-8 115.0 71.0* 13 9 15 27.0 12 12 30 2 反式-乌头酸 4023-65-8 173.0 84.9* 19 11 20 128.9 19 10 13 3 没食子酸 149-91-7 169.0 124.9* 19 15 13 124.5 19 22 13 4 490-79-9 153.0 109.0* 17 14 12 2，5-二羟基苯甲酸 107.9 17 22 11 5 己二酸 124-04-9 145.1 100.9' 17 14 11 83.0 17 13 18 6 绿原酸 327-97-9 353.1 191.0* 18 17 20 84.9 18 44 18 对羟基苯甲酸 99-96-7 137.0 92.9* 16 17 10 65.0 15 29 13 8 3，，44-二羟基苯甲酸 99-50-3 153.0 107.9* 17 22 11 109.0 17 14 11 9 香草酸 121-34-6 167.1 152.0* 12 17 16 107.9 19 18 12 10 咖啡酸 331-39-5 179.0 135.0* 20 16 25 134.0 20 23 24 11 丁香酸 530-57-4 197.1 181.9* 10 13 20 122.9 10 22 13 12 对香豆酸 501-98-4 163.0 119.0* 18 15 12 92.9 18 29 10 13 阿魏酸 1135-24-6 193.1 134.0* 10 16 14 178.0 14 13 20 14 水杨酸 69-72-7 137.0 92.9* 16 17 10 65.0 16 29 13 15 14493-42-6 121.0 76.9* 14 13 19 气代琥珀酸 (ISTD) 101.9 13 14 11 注：*表示定量离子 1.3标准溶液配置 参照 GB/T 40179-2021GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法》标准，使用50%甲醇溶液将14种有机酸成分的混合母液进行逐级稀释，得到浓度分别为 0.1 ug/mL、0.2 ug/mL、0.5ug/mL、1.0 ug/mL、2.0 ug/mL、5.0 ug/mL的标准工作溶液(其中都含有气代琥珀酸内标浓度为 0.25 ug/mL)，待上机分析。 1.4样品前处理方法 参照 GB/T 40179-2021GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定液普色谱-质谱/质谱法》标准。 图1 前处理流程图 结果与讨论 2.1线性范围 参照 GB/T 40179-2021GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法》标准，选用三重四极杆液质联用仪在负模式下进行14种有机酸物质的标准溶液数据采集，14种有机酸物质及气代什珀酸内标物质的 MRM 色谱图如图2所示。将14种有机酸物质按照1.3配制成标准工作溶液，再以目标物与气代琥珀酸内标物的浓度比值为横坐标，峰面积比值为纵坐标，以内标法绘制14种有机酸物质的校准曲线，如图3所示，标准曲线线性关系良好，相关系数R均大于0.999，线性方程情况详见表 3. 图2 14种有机酸及气代琥珀酸内标物质的 MRM 谱图 ConcRatio (ug/m ConcRatio fug/mL) 图3 14种有机酸物质的校准曲线图 表3 14种有机酸物质的校准曲线参数 序号 化合物名称 校准曲线 线性范围((ug/mL) 相关系数R 精确度(%) 1 富马酸 Y=0.3116556X+0.01980725 0.1~5.0 0.9997 85.4~101.7 2 反式-乌头酸 Y=2.166141X+0.02642583 0.1~5.0 0.9998 88.1~101.3 3 没食子酸 Y=2.414882X+0.008589830 0.1~5.0 0.9997 89.7~103.1 4 2，5-二羟基苯甲酸 Y=5.347782X+0.1199270 0.1~5.0 0.9997 85.7~102.3 5 己二酸 Y=1.228473X+0.09740034 0.1~5.0 0.9998 83.9~106.6 6 绿原酸 Y=16.29375X+0.4574784 0.1~5.0 0.9997 84.3~102.3 7 对羟基苯甲酸 Y=6.018663X+0.8700836 0.1~5.0 0.9999 89.9~101.6 8 3，4-二羟基苯甲酸 Y=7.164654X+0.5263946 0.1~5.0 0.9998 93.4~106.1 9 香草酸 Y=0.1889791X+0.01446077 0.1~5.0 0.9998 82.3~100.9 10 咖啡酸 Y=9.329006X+0.05497650 0.1~5.0 0.9998 82.7~92.3 11 丁香酸 Y=0.7861065X+0.05062444 0.1~5.0 0.9995 83.6~102.4 12 对香豆酸 Y=9.492578X+1.127865 0.1~5.0 0.9999 85.9~110.1 13 阿魏酸 Y=1.705056X+0.007933236 0.1~5.0 0.9997 88.6~102.3 14 水杨酸 Y=4.681195X+0.8071207 0.1~5.0 0.9999 89.9~114.1 2.2精密度实验 取低、中、高三个浓度的标准溶液，连续进样6次，仪器精密度实验考察结果详见表4。该结果表明，各物质保留时间的 RSD 在 0.01%~0.30%的范围，峰面积的 RSD 在 0.46%~5.02%的范围，以上数据表明仪器的精密度良好。 表4 精密度实验测试结果((n=6) 序号 化合物名称 RSD%(0.2 ug/mL) RSD% (0.5 ug/mL) RSD% (1.0 ug/mL) 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 富马酸 0.30 3.38 0.22 2.12 0.14 3.18 2 反式-乌头酸 0.22 1.84 0.18 2.60 0.14 1.14 3 没食子酸 0.28 1.78 0.07 2.73 0.14 1.13 4 2，5-二羟基苯甲酸 0.05 1.34 0.05 1.63 0.04 0.99 5 己二酸 0.03 1.29 0.05 2.36 0.03 1.81 6 绿原酸 0.01 0.87 0.03 0.46 0.03 1.04 7 对羟基苯甲酸 0.02 1.75 0.05 2.83 0.03 1.58 8 3，4-二羟基苯甲酸 0.02 1.45 0.05 1.11 0.03 0.68 9 香草酸 0.04 2.62 0.05 2.65 0.04 3.38 10 咖啡酸 0.02 2.20 0.04 1.15 0.03 1.24 11 丁香酸 0.03 5.01 0.05 5.02 0.03 1.91 12 对香豆酸 0.01 1.71 0.03 1.23 0.02 1.37 13 阿魏酸 0.01 2.16 0.02 1.41 0.02 1.22 14 水杨酸 0.02 2.39 0.03 1.33 0.02 1.68 2.3样品加标回收率实验 取食品样品，按照1.4步骤制备样品和样品加标，在低中高三个加标浓度的水平下，进行回收率实验，85.9%~97.6%、83.9%~101.2%、83.4%~101.9%之间，鲜样品的低中高三个浓度梯度的加标回收率分别在84.6%~94.9%、84.8%~102.1%、85.9%~103.8%之间，均满足该检测方法的条件要求。 图4 金银花样品谱图 图5金银花加标160 pg/g样品图谱 图6 橙子样品谱图 图7 橙子加标 24 ug/g 样品图谱 (1.富马酸2.反式-乌头酸3.没食子酸4.2，5-二羟基苯甲酸5.己二酸6.绿原酸7.对羟基苯甲酸8.3，4-二羟基苯甲酸9.香草酸10.咖啡酸11.丁香酸12.对香豆酸13.阿魏酸14.水杨酸15.气代琥珀酸(ISTD)) 表5 样品及加标回收率实验结果：((n=2) 序号 化合物名称 金银花样品含量 金银花样品平均加标回收率(%) 橙子样品含 量平均值 (ug/g) 橙子样品平均加标回收率(%) 平均值 i(ug/g) 80 ug/g 160g/g 320 pg/g 12pg/g 24ug/g 48 ug/g 1 富马酸 N.D. 88.3 87.6 84.2 N.D. 91.6 90.3 89.3 2 反式-乌头酸 N.D. 89.6 84.8 85.7 5.0 88.6 93.4 92.7 3 没食子酸 N.D. 85.9 86.7 86.0 22.5 94.9 102.1 98.3 4 2，5-二羟基苯甲酸 N.D. 92.3 90.1 101.9 N.D. 92.2 93.8 85.9 5 己二酸 N.D. 86.9 88.9 83.4 N.D. 90.7 91.3 89.9 6 绿原酸 348.0 89.4 101.2 92.4 N.D. 87.4 86.6 88.8 7 对羟基苯甲酸 N.D. 93.4 90.1 90.1 N.D. 84.6 85.9 89.8 8 3，4-二羟基苯甲酸 N.D. 97.6 93.6 93.2 N.D. 91.3 92.5 90.6 9 香草酸 N.D. 88.9 84.6 86.7 N.D. 89.4 92.9 90.7 10 咖啡酸 N.D. 90.2 90.8 88.9 N.D. 90.6 91.4 103.8 11 丁香酸 N.D. 93.7 91.3 100.3 N.D. 86.4 84.8 89.7 12 对香豆酸 N.D. 89.4 86.7 88.1 N.D. 90.8 93.8 87.9 13 阿魏酸 N.D. 88.6 83.9 89.3 N.D. 90.7 90.3 89.3 14 水杨酸 N.D. 94.3 91.5 93.4 N.D. 89.9 87.7 88.0 N.D.： 表示未检出。 备注：干样品加标量：低、中、高浓度加标分别为 80 ug/g、160 ug/g、320pg/g； 鲜样品加力量：低、中、高浓度加标分别为 12 ug/g、24 ug/g、48 ug/g。 2.4灵敏度实验 将最低浓度为 0.1 ug/mL 的14种有机酸混合标准溶液，按1.2中的分析条件进行上机测定。通过软件计算分别得到检出限和定量限；14种有机酸成分的检出限和定量限情况详见表6。在上述条件下，14种有机酸物质的LOD 为 0.0003~0.010 ug/mL， LOQ 为 0.001~0.033 ug/mL，(干样LOQ为0.17~5.50 ug/g；鲜样 LOQ为0.03~0.83 ug/g)，测试结果表明仪器灵敏度良好，满足 GB/T 40179-2021GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法》标准中测定低限的要求。 表6检出限和定量限 序号 化合物名称 检出限((ug/mL) 定量限(ug/mL) 干样((ug/g) 鲜样(ug/g) 1 富马酸 0.005 0.016 2.67 0.40 2 反式-乌头酸 0.002 0.008 1.33 0.20 3 没食子酸 0.001 0.004 0.67 0.10 4 2，5-二羟基苯甲酸 0.001 0.004 0.67 0.10 5 己二酸 0.005 0.018 3.00 0.45 6 绿原酸 0.001 0.004 0.67 0.10 7 对羟基苯甲酸 0.0003 0.001 0.17 0.03 8 3，4-二羟基苯甲酸 0.001 0.004 0.67 0.10 9 香草酸 0.010 0.033 5.50 0.83 10 咖啡酸 0.002 0.008 1.33 0.20 11 丁香酸 0.005 0.015 2.50 0.38 12 对香豆酸 0.001 0.004 0.67 0.10 13 阿魏酸 0.002 0.007 1.17 0.18 14 水杨酸 0.001 0.004 0.67 0.10 结论 本实验使用岛津 LCMS-8045 三重四极杆液质联用仪，参照 GB/T 40179-2021GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法》标准，建立了植物源性食品中14种有机酸含量的分析检测方法。该检测方法中14种有机酸物质在0.1~5.0 ug/mL的范围内线性良好，相关系数R均大于0.999；精密度实验中，14种有机酸物质保留时间的 RSD 在0.01%~0.30%的范围，峰面积的RSD 在0.46%~5.02%的范围，仪器精密度良好；在食品样品加标的情况下(干样加标量分别为：80 ug/g、160pg/g 和 320 ug/g；鲜样加标量分别为：12ug/g、24 ug/g 和 48 ug/g)，样品的综合加标回收率分布在 83.4%~103.8%的范围之间，能够满足标准要求；14种有机酸物质的 LOD 为 0.0003~0.010 ug/mL， LOQ 为 0.001~0.033 ug/mL，(干样 LOQ 为 0.17~5.50 ug/g；鲜样 LOQ为 0.03~0.83 ug/g)，测试结果表明仪器灵敏度良好，均能够满足标准要求。岛津 LCMS-8045 液质联用仪具有分析速度快、稳定性良好、结果准确度高等特点，能够满足 GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定液相色谱-质谱/质谱法》的方法需求，也适用于多种相关行业的质量控制及分析检验工作。 岛津应用云 本实验使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪，参照GB/T 40179—2021GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法》标准，建立了植物源性食品中14种有机酸含量的分析检测方法。岛津LCMS-8045液质联用仪具有分析速度快、稳定性良好、结果准确度高等特点，能够满足GB/T 40179-2021《植物中有机酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法》的方法需求，也适用于多种相关行业的质量控制及分析检验工作。