细胞中培养状态分析检测方案(高内涵成像)

SARTORIUS2019年12月11日 A第7天 关键词或短语： 活细胞成像、激活、分化、监测、高级细胞模型 活细胞监测：优化高级细胞模型的工作流程为您的细胞检测带来十足信心 监测是细胞培养工作流程的关键组成部分 利用在细胞来源、操作和检测读数方面的创新进展，研究人员可以更好地重现体内环境，从而推动生物医学研究和再生医学的发展。由于基于细胞的分析方法变得日益复杂，因此从整体动态上的捕捉以及细微的细胞事件的观察都至关重要。在细细培养工作流程中，活细胞成像可以在不干扰样品的情况下提供细胞事件的实时成像数据，从而优化高级模型。 高级细胞检测(如模拟疾病发展以筛选治疗药物的分析)通常需要耗费大量精力去开发，并且涉及多个阶段，在测试前可能需要较长的时间准备。培养工作需要从患者处获取的细胞或诱导的多能干细胞(iPSC)，然后通过分化、活化或基因调控(如CRISPR/Cas9 技术)等多个步骤。此外，可能还需要培养更加复杂的细胞组织，如使用异质培养物或形成 3D结构。 开发日渐复杂的分析方法为该领域的研究人员带来了众多挑战。例如，在细胞处于动态变化时，可能会发生意料之外或不同的变化，从而影响对分析的解读以及最终的成功。在细胞培养过程中，细胞交叉污染或传代增加引起的累积变化也可能导致不良的表型效应。如果采用常规的终点检测方法，我们在研究结束时才能发现问题，这将难以了解问题的产生原因。 鉴于高级细胞培养检测方法的开发需要大量的资金和时间投入，因此持续监测将有效避免不可再生的珍贵细胞资源的浪费。根据细胞培养技术的中心原则，应在细胞培养、细胞操作以及细胞检测(图1)等各个阶段进行细胞质量控制(QC)，而活细胞成像将是这一需求的理想之选。 在细胞培养质量过程中引入活细胞监测还可以帮助研究人员做出更明智的决策，例如了解操作培养物或进行分析的最佳时间。如果发生意外的细胞事件，它能实时识别这些事件并解释其效果，同时还可以对捕获的数据进行回顾性分析，以进一步优化后续研究的条件1。活细胞监测可以与功能性读数相结合，增强相关疾病模型和复杂分析的开发与解释，从而促进各种细胞培养测试的成功。 图1：实时活细胞分析持续支持细胞培养工作流程。监测细胞健康状况、形态和孔板均一性，例如细胞增殖和成熟。监测培养操作的效果，例如分化、活化和药物治疗的效果。监测表型分析，例如动力学形态变化、细胞迁移和吞噬作用。 本白皮书阐述了在复杂、重复的工作流程中进行活细胞监测的重要性，由于能够以无干扰方式执行多参数成像技术，因此对其与免疫学、肿瘤学和神经科学领域的相关性也进行了重点介绍。在这里，我们描述了不同的活细胞监测工具，并举例说明了它们如何在整个工作流程中确保并优化数据质量；重点介绍了如下四个高级应用： 在活细胞分析中，可在整个培养、操作和动力学分析阶段采集图像和数据信息，无需打开细胞培养箱。 ▪活细胞监测工具，用于细胞培养检测的质量控制优化 ·捕捉分化和活化等复杂细胞操作 ·监测干细胞事件，如重编程和分化 ·分析高级3D模型的开发 1.活细胞监测工具能够为细胞培养分析提供关键见解 创新型细胞模型在药物发现领域异军突起，而活细胞成像已经过验证，可为细胞数据和动态信息捕获提供宝贵见解。尽管对于许多研究人员来说，检测读数被奉为“顿悟时刻”，但必须强调的是，细胞培养随时间变化的可视化对于分析质量控制以及实验结果输出同样至关重要。Horbach等人?在2017年发表的论文中强调了这一点的重要性，论文指出：超过30，000项研究中存在未识别的细胞系。随着科学界开始注重提高体外模型的严谨性和可重复性3，活细胞监测可为分析质量和准确度提供独特的机遇。 作为监测系统，活细胞成像和分析是一种通用技术，不 论是否含有标记，都可以根据研究需要测量不同参数。无标记方法可避免与常规荧光显微镜相关的潜在光毒性对细胞的破坏作用4，它在整个细胞培养工作流程中对细胞质量控制起着至关重要的作用。例如，无标记活细胞成像可以通过检测孔表面细胞覆盖率的变化，远程监测细胞数周甚至数月，从而提供定量的汇合度和形态信息。此外，无标记成像提供单个细胞分析，可以测量单个细胞的动力学和关键形态变化，从而表征异质群体中的细胞行为。 细胞成像标记方法可检测动态的生物学变化，而这些变化目前是无法使用无标记分析方法捕获的。例如，活细胞免疫细胞化学(ICC)可以检测与特定细胞发育阶段相关的特定表面蛋白表达的变化，从而检测重要的细胞相互作用和状态，并将其与时间点联系起来。将活细胞成像和分析与 ICC等补充技术相结合，可以获得更多信息；例如通过测量功能和形态变化可以使研究人员为培养操作创建签名。 此外，活细胞成像还可利用与特定应用紧密相关的技术。例如，活细胞成像可以使用明场光学元件实现较大不透明结构的观察，这对于监测3D结构和球体来说十分理想；同时可以使用不同的试剂来检测细胞的健康状况，例如细胞凋亡、细胞毒性和增殖分析。 前沿的细胞培养检测方法可以在长时间内进行多种操作。因此，为了做出有关细胞培养的明智决定，必须了解生物学过程的时间线。最终，可靠的细胞培养质量控制可确保模型从一开始就处于最佳状态，进而验证并改善检测结果。将多参数实时动态监测和细胞健康措施集成到细胞培养工作流程中，可以为科学家提供更多的见解。 由于神经系统疾病具有复杂性和时间动态特性，因此开发生理相关模型以测试该领域的新疗法颇具挑战性。在提供有关这些疾病发病机理的重要见解时，体外模型为筛选潜在药理药物提供了一种有力的方法5。但研究神经系统疾病推定治疗方法的科学家必须确定其细胞培养的最优化；同时由于表型分析可能涉及多种操作，因此必须确保各个阶段的质量和标准化。 在神经元发育过程中，神经元会在较长的时间范围内扩展分化为树突和轴突(神经突)，因此神经元分析可能需要数周甚至数月的时间(在使用干细胞时)发育和操作。依靠常规技术提供的预定终点结果，可能会遗漏或无法准确确定关键的生物学事件。活细胞成像是一种强大的监测工具，可捕获在神经元发育和恶化以及活性药物作用期间发生的细微形态波动。活细胞成像是一种必要的质量控制方法， 它能够在开发神经退行性疾病的体外模型(例如阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏病)时，提供敏锐的时空洞察力，此外还支持神经经发育因素研究6-8。 通过使用无标记多参数测量，活细胞成像和分析可以量化神经突的发育(长度、分支点)、细胞迁移和增殖。将这些数据相结合，可表征和确认随时间变化的分化阶段(图2)。将相差成像与不受干扰的核限制性荧光团相结合，能够为细胞周期事件带来更深入的信息。例如，用神经突生长和核分裂的持续监测指代分化，科学家可以确定其分化实验是否成功，并客观确定其神经元培养物的发育阶段，从而使他们前进到下一个实验阶段。如下所示，随着时间的推移，神经突生长的增加和细胞分裂的减少表明神经元分化(图2A和C)。 相差成像和核荧光标记可动态监测随时间变化的神经突生长和细胞分裂 ( 图2：使用相差成像和核计数 (Nuclight-Orange) 可视化的 SH-SY5Y 神经母细胞瘤分化。联合 atRA (10pM) 和 BDNF (50ng/mL)，通过逐渐血清饥饿 (10%-0% ) 将稳定转染的 SH-SY5Y神 经母细胞瘤进行分化，并使用 Incucyte@监测14天。 ( A)未分化或(B)分化神经元的相差和荧光图像。注意，未分化细胞的融合度更高，神经突水平更低。(C)细胞计数分析表明，分化细胞中细胞分裂较低。 ( (D)神经突生长分析表明，分化细胞中神经突的长度更长。 ) 活化 活化， CD71 相差成像和荧光表面标记可动态监测随时间变化的PBMC 活化 图3：使用相差成像和活细胞ICC(抗CD71FabFluor-488)可视化PBMC活化。PBMC (30000个/孔)利用抗 CD3和IL-2或阴性对照处理，使用抗 CD71FabFluor-488 标记。，(A)无标记相差成像可检测未活化和活化的 PBMC 之间的形态差异；相差成像与活细胞 ICC结合显示活化细胞中 CD71+上调。 (B)在较大和较小细胞亚群中，活化诱导细胞大小和细胞偏心率的增加，以及 CD71+的上调。 细胞大小 时间(h) 细胞形状 平均偏心率 0.70 亚群中 CD71+表达% 创新免疫学研究中使用的细胞培养非常复杂，通常涉及多种操作，其中质量控制是各个阶段成功的基础。对外周血单核细胞(PBMC) 等免疫细胞活性的了解对于探索宿主防御机制和疾病发病机理以及进行免疫疗法的毒理检测至关重要。免疫细胞活化是科学家研究体外适应性免疫反应的关键操作阶段； PBMC可以通过不同的细胞因子和抗体来刺激免疫细胞的活化。 活细胞 ICC 可随时间变化跟踪蛋白质定位的动态变化，而像常规 ICC 仅局限于单个时间点。无标记成像还可以捕捉 细胞形状和结构的变化，包括细胞偏心率和伸长率。跟踪这些形态变化可以掌握细胞健康状况以及信号传导调制°。 通过将 CD71+ 蛋白表达与无标记相差成像相结合， PBMC的活化能够与时间依赖的形态变化相联系，例如细胞大小和形状(图3)。活细胞 ICC 还可以识别异质细胞群中不同的细胞亚群，通过使用多个标记，不同的细胞类型及其与靶标的相互作用也可以进行监测和表征。 3.干细胞培养操作过程中重编程和分化的动态监测 鉴于 iPSC模型能够重现患者特定表型，因而它在神经科学、免疫学和肿瘤学领域受到越来越多的关注。 iPSC 模型之所以广受欢迎，是因为它可以产生大量人源化疾病模型，有助于细胞修复遗传机制以及高通量药物筛选应用的研究10。iPSC 还可以用于个体化治疗， iPSC 衍生的细胞有助于评估药物对个体基因组表型的作用。 与在胚胎发育过程中发育的人类胚胎干细胞不同的是，iPSC 是人工衍生的多能细胞。 iPSC 是用于疾病建模和发育研究必不可少的工具，在功能筛选分析方面具有巨大潜力1011。通过将干细胞特异性转录因子引入未成熟或成熟的体细胞类型中，能够从已经分化的细胞类型中创建 iPSC。 体细胞重编程能够为创新型研究制造宝贵的iPSC， 但同时也为细胞质量控制带来了全新的技术挑战与要求。尽管已证明这一技术十分成功，但在0.00001-1% 之间的转化率使细胞重编程成为相对罕见的事件，从而难以检测和确认。 编程是一个动态过程，可能需要数周甚至数月才能完成；同时在整个时间过程中无法实现所有细胞的可视化，因而细胞事件可能会丢失或被误解，导致时间和资源的浪费。总之，从体细胞重编程到 iPSC 分化的整个过程中，持续监测细胞有助于确保结果的可信度。 包含活细胞分析的质量控制监测可在更长的时间范围内提供实时数据，让研究人员能够检测和表征极为罕见的事件。此外，， 它还能够拍摄整板，让用户看到重编程事件(例如克隆形成)，在建立克隆之前确保其质量。可以使用无标记成像跟踪克隆的形成，这种成像可以显示克隆的形态、大小和生长特征(图4A)。对于发育和再生医学中使用的iPSC， 持续稳定的多能性是必要的。监测 iPSC 克隆的形成，以及使用 ICC标记多能性标志物(例如 SSEA4 和 OCT4)测试已分离的样品，这可以为开发 iPSC 的科学家提供数据支撑(图4B)。 第12天 第17天 um300 um .B 图4：使用相差成像和 ICC (SSEA4-AF-488 和 OCT4-AF-594)实现新生儿包皮成纤维细胞重编程为 iPSC 的可视化。采用CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒(含山中因子的病毒)处理，诱导新生儿包皮成纤维细胞重编程为iPSC。(A)全孔图像(4倍)证明在在加试剂后第12天出现了独特的 iPSC 克隆。to(B)固定分离的克隆，同时用靶向多能性标志物的 SSEA4-AF-488和 OCT4-AF-594 抗体染色，证实了 iPSC的多能性。 相差成像可动态监测 iPSC 的生成和菌落的出现，同时荧光表面标记可确认多能性 iPSC模型的关键优势在于，它们可以开发大脑等组织的人源化模型，因为这些组织通常在原位难以获得。通过利用活细胞监测来获得融合度测量结果并观察神经元成熟所特有的形态变化，可以监测出现的克隆发展(图5)。在体外iPSC 衍生的疾病模型中，细胞发育和形态变化的轨迹可能是多变的，并且随着时间的推移，偶然累积的细微变化可能导致不良表型效应1。因此，应在各个阶段进行质量控制以监测神经元细胞系的健康和功能。 B 0h 3d 6d 无标记和形态分割技术实时监测 iPSC 衍生的细胞分化 C. 神经突长度 图5：利用无标记相差成像和形态分割，可视化 iPSC 衍生的神经祖细胞分化成皮层神经元。无标记相差成像方法可以捕捉随时间变化的细胞。(A)神经祖细胞显示了分化后神经元表型特征的细胞体形态变化，以及随时间变化的神经突生长的增加。(B)准确的全细胞分割提取并测量所获取图像中的形态特征变化，突出显示细胞体(橙色)和神经突(粉红色)。(C)分化后神经突增生证实分化成功。 4.复杂实验的活细胞监测：3D球体形成 三维(3D)细胞培养系统的创建是药物发现和组织工程研究的重点。这些技术证明体内环境复杂性和可翻译性增加，并且与2D结构相比，长期传代后 3D 结构中的细胞通常可以更好地保持分化和克隆扩增。与2D结构相比，3D结构可以提供更多与体内相关的、转译的体外模型，因而受到广泛关注。诸如多球体和类器官等先进的3D结构可以更好地复制体内细胞环境和器官的微结构，在肿瘤学和肝毒性领域显示出巨大潜力。 根据细胞和组织来源以及实验目的，3D培养物可以使用无支架或基于支架的培养系统。制备球体的无支架方法可提供相对简单的3D细胞培养途径，能够应用于广泛的细胞类型，因而广受欢迎。广义上讲，无支架技术可分为如下方法，一种是动态的方法，即不断搅拌悬浮液中的细胞以形成聚体；另一种是静态的方法，即在重力作用下发生聚集13。这些过程可促进细胞间粘附，同时诱导多细胞球体的自组装，从而分泌其自身细胞外基质成分 (ECM)。 DF-BF图像+BF轮廓 +BF轮廓 a.-基质胶 a. SK-BR-3 b.+2.5%基质胶 b. +NHDF c. 最大 BF 面积x104 8pm2- c.总 BF 面积x1059pm²/图像 借助明场成像对球体发育和最佳生长条件进行活细胞监测 图6：使用明场光学元件实现单个和多个球体的可视化。 (A)将 MDA-MB 231 细胞接种在没有或含有 Matrigel@的96孔圆底ULA孔板中(4000个细胞/孔， 2.5% Matrigel@v/v) 培养并观察6天。用黄色轮廓显示 Incucyte@扩展景深(DF-BF)(接种后3天)图像。以4倍放大率拍摄所有图像。(a)在没有 Matrigel@的情况下， MDA-MB-231细胞无法形成致密的球体。(b)在 Matrigel存在下形成紧密的球体。(c)相应的时间图(最大BF面积)显示，在存在 Matrigel@的情况下，球体的生长增加。 (B) 将 SK-BR-3乳腺癌细胞接种在预先包被 Matrigel@的96孔平底板中，单独培养或与正常人真皮成纤维细胞 (NHDF)(1：1比例，1000个细胞/孔)共培养。用黄色轮廓显示Incucyte@DF-BF图像(接种后8天)。(a)在缺少 NHDF的情况下， SK-BR-3细胞无法形成致密的多球体。((b)NHDF 帮助形成更致密的球体。 (c) 随时间显示动力学定量和NHDF对球体大小的影响。 相反，基于支架的球体系统模仿天然 ECM， 并复制特定组织的微环境，以促进细胞生长和迁移14。支架可以由许多不同的合成和生物材料制成，例如微载体、微图案板乃至复杂的微流控系统。或者是 Matrigel@等天然 ECM 凝胶以及水凝胶等聚合物结构可提供结构基质15，其中胶原蛋白、层粘连蛋白或藻酸盐可用于构建由纤维网络构成的预制支架，细胞可以通过这种支架轻松迁移1。 ECM 和基质细胞支架可以更贴近肿瘤微环境，因此提高了用于检测化合物的球体检测的预测精度。 活细胞成像的未来展望 高级细胞培养在基础科学、疾病建模和新型疗法开发领域的众多应用中具有光明的前景。面对不断增长的药物消耗率，模拟生物学发育和疾病状态的细胞培养在加快药物发现过程方面具有巨大潜力。 类器官是一种快速发展的体外3D细胞培养技术，展示了器官特异性细胞类型的真实组织学结构，并且可以像在体内一样进行发育和自组织"。我们正在开发这些前沿的3D结构，，以更加模拟器官功能，在吸收、分布、代谢、排泄和毒理学(ADME-tox) 药物筛选实验中提供更高临床相关性的细胞学数据。 “器官芯片”是另一种先进且复杂的细胞应用，该技术可在微流细胞培养芯片上容纳人体器官的微型模型。这些芯片可以通过重建人体器官的微环境、结构和功能复杂性来产生与临床相关的疾病表型和药理反应。微流平台可连接来自多个器官的细胞培养物，从而重现“人体芯片”，以评估多系统中药物的效果。通过优化各个组件的质量控制，这种相互联系的高级细胞培养方法可以提供众多优势。对于在构造过程中使用复杂3D结构以及患者来源iPSC时，这种方法尤其有效。 尽管这些技术应用于众多研究领域之中，但可重复且统一的3D球体检测在技术上极富挑战性，和时间上的不可预测性。此外，与2D培养细胞相比，除了在结构上具有多样性，3D模型还表现出更复杂的形态和功能，凸显了培养、实验方案和分析的标准化需求。 活细胞监测为3D细胞培养和分析的复杂工作流程提供了解决方案。通过使用活细胞成像对球体的发生进行监测和质量控制，科学家可以提高他们对球体形成的了解。它还能够实现球体生长和发展的可视化，测量球体大小、形状和均匀性，让研究人员能够评估诸如 ECM 类型以及共培养等最佳生长条件(图6)。 鉴于这种高级细胞培养会在未来的个性化治疗中发挥关键作用，因此质量控制必须确保患者的安全和数据的完整性。随着技术的进步，在细胞生产的各个阶段进行3D细胞培养的质量控制将提高细胞质量、数量和功效，从而使“细胞疗法”成为现实。 在寻找针对癌症、神经系统疾病、心力衰竭以及其他罕见疾病的新治疗方法方赛中，利用 CRISPR/Cas 技术进行基因编辑已成为一个强有力的参赛选手。随着该应用的扩展，我们亟需监测细胞培养，从而评估时间和空间下游脱靶效应18。活细胞成像和分析是一种实用的解决方案，能够识别细胞行为的变化，允许对脱靶效应及其原因进行研究，弥补了其他分析技术的不足。 高级细胞培养检测的发展为众多领域带来了希望，但是良好和持续的质量控制才是成功的决定因素。活细胞分析将自动捕获、多参数数据分析与AI或机器学习工作流程实时结合，能够从检测中获得知识和检测趋势。活细胞分析无需使用预定义参数即可捕获、监测和分析数据，已经成为前沿细胞模型的黄金标准。 活细胞成像和分析可确保分析质量，能够在细胞分析工作流程的各个阶段为科学家提供帮助。在研究过程中不断监测细胞培养可以增进对细胞事件的理解；通过回顾性评估图像，科学家能够做出更明智的决定。我们投入了大量时间和资金开发创新的实验方法，而活细胞监测能够确保资源的有效利用，其非侵入性和细胞节省特性进一步强化了资源利用率。 更多出版物： https：//www.essenbioscience.com/en/resources/publications/ ( 参考文献 ) ( 1. 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