活细胞中实时分析检测方案(高内涵成像)

突变K-Ras是癌症中最为常见基因突变之一，它存在于约25%的肿瘤中，是热门的肿瘤靶点。2021年，针对K-Ras（G12C）的小分子药物Sotorasib获得FDA批准上市，用于治疗该基因突变的晚期非小细胞肺癌患者。Sotorasib发现新抗体与其他肿瘤药物一样，Sotorasib也会产生药物耐受性！为了解决耐药性问题，Sotorasib发明人之一加州大学旧金山分校Kevan Shokat博士，又找到了另外一个针对K-Ras突变的小分子ARS1620。ARS1620同样可以靶向K-Ras（G12C），阻止肿瘤的生长。除此之外，ARS1620与突变的K-Ras蛋白结合的一段多肽会被癌细胞呈递到细胞表面。所以，该课题组找到了另外一个针对该多肽的抗体P1A4，用于和ARS1620的联合疗法，该成果也被发表在近期的Cancer Cell杂志上（IF=31.7）[1]。顶尖的实验室必定需要顶尖设备的加持 ，这篇成果同时使用到了Sartorius的Octet® 非标记分子互作系统和Incucyte® 实时活细胞分析系统。联合疗法示意图：ARS1620可以共价结合K-Ras突变体的G12C位点，被溶酶体降解后，小分子和多肽的复合物可以被MHC I递呈，并被抗体结合。抗体-递呈多肽亲和力检测Octet® 非标记分子互作系统因为其使用的便捷性和数据准确性，是被美国药典认可的亲和力检测标准（点击了解更多）。用其筛选出一个Fab，与药物多肽二重复合物的亲和力和与药物多肽MHC分子三重复合物的亲和力类似，都可以与两者比较强的结合。基于该Fab做出了抗CD3和抗该小分子/多肽的双特异性抗体P1A4。Octet® Red 384（现为Octet® RH16）数据，用链霉亲和素传感器固化多肽，或者多肽MHC复合物，与抗体进行结合解离。该文中有大量候选抗体与多肽，多肽/MHC复合物的Octet® 亲和力检测数据，在此不一一罗列。Octet® 提供多种通量的仪器，本文使用的是16通道高通量仪器，非常适合用于基于亲和力的药物筛选。细胞增殖与免疫细胞杀伤实验双特异性抗体P1A4抗体同时结合效应细胞上的CD3和K-Ras突变的肿瘤细胞，达到精确免疫治疗的目的。K-Ras突变的SW1573细胞系耐受单独的小分子药物，但是用双特异抗体/小分子联合疗法后，仍然对其有良好的杀伤作用。使用Incucyte® 进行实时活细胞成像分析，并计算药物的IC50以及免疫细胞的杀伤效果。查看Incucyte® 介绍。Incucyte® 计算72小时的细胞增殖，每2个小时拍摄一次，使用Incucyte® Nuclight 慢病毒转染试剂盒转染靶细胞，使其带有红色荧光。计算红色荧光细胞数量。使用Incucyte® Nuclight 慢病毒转染试剂盒转染靶细胞，使其带有红色荧光。然后加入免疫细胞PBMC，加入小分子/抗体，或者只加入小分子。用Incucyte®计算72小时的细胞增殖，每2个小时拍摄一次，计算红色荧光细胞数量。Incucyte® 进行活细胞成像后的培养完毕的细胞，进行处理然后用流式细胞仪检测T细胞的活化。发现联合疗法的T细胞明显发生了活化。Summary为何选择Incucyte® 实时活细胞分析系统？培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害；本文做了共计3天杀伤实验，每隔2小时自动拍摄。而且克服了终点法（比如流式）的细胞处理过程带来的繁琐操作和细胞活性丧失等问题。6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高；这篇文章有各种免疫抑制剂、效靶比等实验组，Incucyte® 一次可以完成所有实验组实验。高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；本文主要用IC50计算等功能。大于100种优化过的荧光试剂和耗材及详尽的Protocol，本文用了Incucyte® 配套的慢病毒转染试剂。如果您也不想再把细胞拿进拿出的拍摄，来试试Incucyte® 实时活细胞分析系统吧！如果想在短时间内获得更精确的亲和力结果，来试试Octet® 非标记分子互作系统吧！下载文档《实时活细胞分析开启免疫细胞杀伤实验新格局》-参考文献-[1] A covalent inhibitor of f(G12C) induces MHC class I presentation of haptenated peptide neoepitopes targetable by immunotherapy. 2022, Cancer Cell 40, 1060–1069