药品中氨基酸分析检测方案(柱后衍生装置)

METHOD ABSTRACT/391 CATALYST FOR SUCCESS 氨基酸分析法(欧洲药典8.0) 欧洲药典规定了药品、生产用原材料与合成用中间体成份的定性、定量和所有的检验项目。 欧洲药典的内容包括活性物质、辅料、化学、动物、人或植物来源的药用物质或制品、顺势疗法制剂和顺势疗法原料、抗生素，以及制剂和容器等。欧洲药典还适用于生物制品、血液和血浆制品、疫苗和放射药品。欧洲药典的内容具有法律约束力，由行政管理或司法部门强制要求符合欧洲药典。成员国的国家当局必须采用欧洲药典，必要时可替代相同物质国家标准中的个论。 所有药品、药用物质生产企业在欧洲销售或使用其产品时，都必须遵循欧洲药典标准。 氨基酸分析的用途： ——通过氨基酸成分分析，鉴别测试生物制药的活性成分(如多肽、蛋白质等) ——API(活性药物成分，游离氨基酸)和中间体的杂质和有关物质检测； ——药品中单一或总氨基酸含量，包括复杂基质标记物检测； 欧洲药典已经正式的发布了一些氨基酸测定的茚三酮柱后衍生法的专题，接下来会发布更多的相关内容： - Cysteine HCl Monohydrate 01/2014：0895 -Arginine 07/2014：0806 Pickering参照欧洲药典8.0，提供了完整的氨基酸分析解决方案。方案包括Pinnacle PCX柱后衍生仪、色谱柱和保护柱、缓冲液和茚三酮衍生试剂。 Pinnacle PCX可以修改运行条件，执行温度梯度程序，缩短运行时间加速氨基酸分离。本例所示方法符合欧洲药典8.0的系统适用性要求。 药典阐述了测试前的准备及特定氨基酸的参考方法。参考方法用于计算百分含量、杂质水平及参数的系统适用性。其中亮氨酸和异亮氨酸分离度要大于1.5。 表1欧洲药典8.0参考指南 REFERENCE SOLUTIONS，UG/ML Amino acids Test solutions ug/mL CysCSSC Lys Ser Thr Val Ala ArgLeu Ile Ile and Leu Pro NH4 Valine 600 1.2 1.2 3 each 1.2 0.12 Proline 600 0.6 3 each 1.2 0.12 Leucine 600 and 24 1.2 0.12 3 each 1.2 0.12 Threonine 600 1.2 3 each 1.2 0.12 Serine 600 1.2 3 each 1.2 0.12 Lysine 600 1.2 3 each 1.2 0.12 Isoleucine 600 1.2 1.2 1.2 3 each 1.2 0.12 Arginine 600 1.2 1.2 3 each 1.2 0.12 Cysteine 600 1.2 1.2 3 each 1.2 0.12 Cys=Cysteine， CSSC=Cystine， Lys =Lysine， Ser= Serine， Thr=Threonine， Val= Valine， Ala =Alanine， Arg = Arginine， Ile=Isoleucine， Leu=Leucine， Pro=Proline，NH4=ammonia 除半胱氨酸外，钠离子检测法和锂离子检测法对其它氨基酸都适用，半胱氨酸用锂离子检测法。钠离子检测法运行时间短，是除半胱氨酸外其它氨基酸的首选检测法。 用高效钠离子交换柱检测以下氨基酸：缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸 分析条件 色谱柱：高效钠离子交换柱 4.6*110 mm， 货号1154110T 流速：0.6 mL/min 流动相：见表2 进样体积：50 uL 柱后衍生条件 柱后衍生系统： Pinnacle PCX 反应器体积：0.5 mL 试剂： Trione@茚三酮 反应温度：130°℃ 柱温：见表3 流速：0.3mL/min 检测波长： UV/Vis 570 nm一级氨基酸，440 nm二级氨基酸 表2.HPLC梯度程序(115411T) NA315 NA425 NA640 RG011 0 100 0 0 0 4 100 0 0 0 23 10 90 0 0 24 0 0 100 0 42 0 0 100 0 42.1 0 0 0 100 45 0 0 0 100 45.1 100 0 0 0 55 100 0 0 0 表3.柱温程序 图1：欧洲药典8.0方法分析氨基酸的钠柱色谱图一(浓度3 ug/mL， 进样体积50 uL) 图2：欧洲药典8.0方法分析氨基酸的钠柱色谱图二(浓度3 ug/mL，进样体积50 uL) 0 图3：氨基酸分析钠柱色谱图，以欧洲药典8.0方法计算系统适应性检查(参考表1). Proline -1.2 ug/mL； Isoleucine-3 ug/mL； Leucine-3 ug/mL； 图4：低含量水平异亮氨酸参比溶液钠柱色谱图浓度0.12 ug/mL. 进样体积50 uL 图5：600 ug/mL异亮氨酸测试溶液钠柱色谱图(放大)进样体积50 uL 0 图6：600 ug/mL脯氨酸测试溶液钠柱色谱图(放大)进样体积50 uL 图7：600 ug/mL 亮氨酸测试溶液钠柱色谱图(放大)进样体积50 uL 图8：600 ug/mL缬氨酸测试溶液钠柱色谱图(放大)进样体积50 uL 图9：600 ug/mL赖氨酸测试溶液钠柱色谱图(放大)进样体积50uL 由于钠离子分离法对半胱氨酸和脯氨酸的分离度较低，欧洲药典8.0中用高效锂离子交换柱分离半胱氨酸和脯氨酸，该方法也可以用作其它氨基酸的检测，只是会比钠离子分离法耗时长。用高效锂离子交换柱可测定以下氨基酸：半胱氨酸、缬氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸。 分析条件 色谱柱：高效锂离子交换柱 4.6x75mm， 货号0354675T 流速：0.55mL/min 流动相：见表4 进样体本：50uL 柱后衍生条件 柱后衍生系统： Pinnacle PCX 反应器体积： 0.5mL 试剂： Trione@茚三酮试剂 反应温度：130°℃ 柱温：见表5 流速：0.3 mL/min TIME 1700-1125 LI365 LI375 RG003 0 100 0 0 0 15 100 0 0 0 35 40 60 0 0 38 0 100 0 0 43 0 100 0 0 43.1 0 0 100 0 57 0 0 100 0 57.1 0 0 0 100 60 0 0 0 100 60.1 100 0 0 0 72 100 0 0 0 表5.柱温程序 图10：半胱氨酸参比溶液锂柱色谱图(浓度3 ug/mL， 进样体积50 uL injection). 0 图11：以欧洲药典8.0方法分析氨基酸的锂柱色谱图(浓度3 ug/mL each，进样体积50uL). Pickering提供氨基酸柱后衍生分析包，包括色谱柱、保护柱及相关试剂，分析包中的各部分也可根据需要单独购买。. PN DESCRIPTION 0352-0057 30-Minute High Efficiency Protein Hydrolysate Kit (for Sodium methods)： 1154110T 30-Minute Sodium Cation-exchange Column 4.6x 110 mm &1700-0070 amino acid test mixture 1700-3102 Cation-exchange GARDTM assembly： Holder w/ 2 replaceable GARDTM Na220 Sodium Diluent， pH2.20，4x250 mL Na315 Sodium Eluant， pH 3.15，4x 950 mL Na425 Sodium Eluant， pH4.25 Na640 Sodium Eluant， pH 6.40 RG011 Sodium Column Regenerant， 950 mL T100C TRIONEe Ninhydrin Reagent， 4x 950 mL (4-month shelf life) 012506H Sodium Calibration Standard， for protein hydrolysate， 0.25 umole/mL，5 mL 0352-0058 Kit Identical to 0352-0057 with T200 replacing T100C： T200 TRIONEs Two-part Ninhydrin Reagent， prepares 4 x 900 mL (12-month shelf 0352-0006 70-minute Physiologic Fluid/Native Sample Kit (for Lithium methods)： 0354675T Lithium Ion-exchange Column， 4.6 x 75 mm (with test mixture 1700-0070) 1700-3102 Cation-exchange GARDTM assembly： Holder w/ 2 replaceable GARDTM 1700-1125 Lithium Eluant， pH 2.80，4x950 mL Li220 Lithium Diluent， pH 2.20， 4x250 mL Li365 Lithium Diluent， pH 3.65， 4x950 mL Li375 Lithium Diluent， pH 3.75，4x950 mL RG003 Lithium Column Regenerant， 950 mL 1700-0170 Lithium Calibration Standard， without Norleucine andAGPA， 0.25 umole/mL，5 mL SP100 SERAPREPTM，250 mL UP100 URIPREPTM， 250 mL T100C TRIONEe Ninhydrin Reagent， 4x 950 mL (3-month shelf life) 0352-0007 Kit Identical to 0352-0006 with T200 replacing T100C： T200 TRIONEe Two-part Ninhydrin Reagent，prepares 4 x 900 mL (12-month shelf 其他欧洲药典8.0方法陆续更新 PICKERINGLABORATORIL 欧洲药典规定了药品、生产用原材料与合成用中间体成份的定性、定量和所有的检验项目。欧洲药典的内容包括活性物质、辅料、化学、动物、人或植物来源的药用物质或制品、顺势疗法制剂和顺势疗法原料、抗生素，以及制剂和容器等。欧洲药典还适用于生物制品、血液和血浆制品、疫苗和放射药品。欧洲药典的内容具有法律约束力，由行政管理或司法部门强制要求符合欧洲药典。成员国的国家当局必须采用欧洲药典，必要时可替代相同物质国家标准中的个论。所有药品、药用物质生产企业在欧洲销售或使用其产品时，都必须遵循欧洲药典标准。Pickering参照欧洲药典8.0，提供了完整的氨基酸分析解决方案。方案包括Pinnacle PCX柱后衍生仪、色谱柱和保护柱、缓冲液和茚三酮衍生试剂。Pinnacle PCX可以修改运行条件，执行温度梯度程序，缩短运行时间加速氨基酸分离。本例所示方法符合欧洲药典8.0的系统适用性要求。