牛奶中雌激素残留检测方案(液质联用仪)

SSL-CA22-071Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-628 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. - Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 测定牛奶中的雌激素残留 LCMSMS-628 摘要：本文建立了使用岛津超高效液液色谱三重四四极质谱联用测定牛奶中雌激素残留量的方法，8种雌激素在1 ug/L~200.0 ug/L浓度范围内线性良好，相关系数r均在0.999以上。在高、中、低三个浓度下，标样保留时间和峰面积的 RSD%分别在0.04%~0.16%和1.13%~7.40%之间，仪器精密度良好。加标浓度为1、5和20 ug/kg的样品，回收率在81.9~122.6%之间。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，，可用于牛奶中雌激素的准确检测。 雌激素是一类化学结构相似、具有生物活性的类固醇激素，具有影响动物性别分化、缩短动物生长周期的效应。雌激素在奶牛养殖业被广泛使用，以提高奶牛的产奶量，使得雌激素在牛奶中残留。近年来，已经有大量研究证明：雌激素通过食物链进入人体可能会诱发乳腺、·子宫、睾丸、骨、肾和其他一些组织的癌症。中华人民共和国农业农村部公告第250号已明确将己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚及其盐、酯列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单中。考虑到牛奶的主要消费对象为新生儿和青春期前儿童， 他们处于生长发育的关键时期且对雌激素高度敏感。因此牛奶中各种类固醇类雌激素的分析和检测意义十分重大。 为了保障人们的食品安全，农业农村部首次发布了《GB 31658.9-2021动物性食品及尿液中雌激素类药物多残留的测定液相色谱一串联质谱法》，本文参考该标准，建立了牛奶中雌激素残留的检测方法，试样中残留的药物经酶解后用乙腈提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。 系统控制器： SCL-40自动进样器： SIL-40C X3输液泵：LC-40DX3×2质谱仪： LCMS-8050柱温箱： CTO-40C色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99在线脱气机： DGU-405 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack Velox SP-C18 (100 mmx2.1 mml.D.， 1.8 um)岛津((上海)实验器材有限公司，P/N： 227-32001-03 流动相：A相-水，B相-乙腈 流速：0.4mL/min 柱温：40℃进样体积：10uL 洗脱方式：梯度洗脱，，初始浓度为B相20%，时间程序见表1 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 20 7.00 Pumps Pump B Conc. 55 8.00 Pumps Pump B Conc. 55 8.10 Pumps Pump B Conc. 20 10.00 Controller Stop 质谱条件 离子源： ESI，负离子模式 DL 管温度：250℃ 接口电压： -3.5 kV雾化气：氮气3.0 L/min干燥气：氮气10L/min 加热模块温度：400℃ 接口温度：300℃ 扫描模式：多反应监测 (MRM) 加热气：空气10 L/min MRM 参数：见表2 碰撞气：氩气(230kPa) 表2 MRM参数 编号 化合物名称 英文名称 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 145.1* 19.0 37.0 30.0 1 雌三醇 Estriol 50-27-1 287.2 171.2 14.0 37.0 11.0 2 17β-雌二醇 17B-estradiol 50-28-2 271.2 145.1* 183.1 19.0 13.0 42.0 40.0 27.0 17.0 3 17a-雌w二醇 17a-estradiol 57-91-0 271.2 145.1* 183.1 10.0 19.0 40.0 37.0 14.0 18.0 4 炔雌醇 Ethinyleatradiol 57-63-6 295.2 145.1* 159.1 19.0 13.0 41.0 43.0 14.0 12.0 5 雌酮 Estrone 53-16-7 269.2 145.1* 159.2 10.0 10.0 38.0 34.0 16.0 18.0 6 己烯雌酚 Diethylstibestrol 6898-97-1 267.2 237.1* 251.2 10.0 12.0 28.0 24.0 16.0 17.0 84-17-3 265.2 93.1* 13.0 27.0 13.0 7 己二烯雌酚 Dienestrol 249.2 13.0 26.0 17.0 8 己烷雌酚 Hexestrol 84-16-2 269.2 134.1* 119.1 10.0 10.0 15.0 40.0 13.0 23.0 9 雌三醇-D3 Estriol-D3 / 290.2 173.2 20.0 38.0 11.0 10 173-雌二醇-D2 17B-estradiol-D2 / 273.2 147.1 19.0 41.0 16.0 11 雌酮-D2 Estrone-D2 / 271.2 145.1 13.0 38.0 14.0 12 己烯雌酚-D8 Diethylstibestrol-D8 / 275.2 259.1 10.0 27.0 12.0 13 己烷雌酚-D4 Hexestrol-D4 / 273.2 136.1 13.0 16.0 26.0 *表示定量离子 标准品溶液的配制及样品前处理 标准工作溶液配制： 参考《GB 31658.9-2021动物性食品及尿液中雌激素类药物多残留的测定液相色谱一串联质谱法》中标准溶液的制备方法配制标准储备液及工作液。 校准曲线溶液的制备： 使用 40%乙腈溶液将混合标准中间液逐级稀释成浓度为1.0、2.0、5.0、20、50和200 ug/L的系列标准工作曲线溶液，每一标准工作溶液含各内标浓度均为 5.0 ug/L。 样品前处理： 参考《GB 31658.9-2021动物性食品及尿液中雌激素类药物多残留的测定液相色谱一串关质谱法》样品前处理方法。 结果与讨论 3.1雌激素标准溶液谱图 配制的1ng/mL混合标准溶液，上机分析，得到8种雌激素药物的 MRM 色谱图，详见图1，色谱峰形良好，通道无干扰。 图1l 1ng/mL8种雌激素标准品溶液 MRM 色谱图 (1、雌三醇；2、17β-雌二醇；3、17a-雌二醇；4、炔雌醇；5、雌酮；6、己烯雌酚；7、己二烯雌酚；8、己烷雌酚) 3.2线性关系 将1.0、2.0、5.0、20、50、100和200 ug/L的系列混合标准工作液(内标5pg/L)按1.2中的分析条件进行测定，内标法定量。以浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，绘制校准曲线如图2所示。雌激素校准曲线及检测限、定量限的结果见表3. 图2 雌激素校准曲线 表3 8种雌激素校准曲线及检测限、定量限 编号 化合物 校准曲线 相关性 系数R 检测限 (ng/mL) 定量限 (ng/mL) 1 雌三醇 Y=(0.190460)X+(0.250012) 0.9998 0.10 0.33 2 17β-雌二醇 Y=(0.141392)X+(0.272526) 0.9997 0.07 0.25 3 17a-雌二醇 Y=(0.254729)X+(0.827171) 0.9992 0.05 0.17 4 炔雌醇 Y=(0.0209359)X+(0.0703085) 0.9992 0.09 0.31 5 雌酮 Y=(0.166684)X+(0.192992) 0.9997 0.02 0.07 6 己烯雌酚 Y=(0.197262)X+(0.270447) 0.9995 0.02 0.05 7 己二烯雌酚 Y=(0.130653)X+(-0.136532) 0.9995 0.05 0.18 8 己烷雌酚 Y=(0.223702)X+(0.0983533) 0.9999 0.01 0.02 3.3精密度 对1 ug/L、20 ug/L和200 ug/L三个浓度标准工作液连续测定6次，考察仪器精密度。结果显示：不同浓度标准品保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.04%~0.16%和1.13%~7.40%之间，仪器精密度良好。 表4 雌激素保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 编号 化合物 RSD% (1ug/L) RSD%(20ug/L) RSD% (200ug/L) R.T Area R.T Area R.T Area 1 雌三醇 0.08 4.58 0.16 2.70 0.04 1.78 2 17β-雌二醇 0.04 7.40 0.09 3.70 0.04 3.76 3 17a-雌二醇 0.05 5.30 0.09 1.13 0.04 2.58 4 炔雌醇 0.04 5.90 0.09 2.12 0.04 1.89 5 雌酮 0.05 5.32 0.08 2.99 0.04 2.86 6 己烯雌酚 0.05 3.75 0.08 2.63 0.04 1.41 7 己二烯雌酚 0.05 5.49 0.08 1.50 0.04 1.78 8 己烷雌酚 0.04 6.88 0.08 2.17 0.04 2.42 3.4回收率 取空白牛奶5 g，加入少量雌激素标准工作液，使加标浓度为1、5和20 ug/kg，样品经提取与净化后，按照1.2中的分析条件测定雌激素的加标回收率，平行测定3次。8种雌激素的回收率在81.9~122.6%之间，具体结果见表 5。 表5 雌激素回收率结果(n=3) 编号 化合物 加标浓度1ug/kg 加标浓度 5 ug/kg 加标浓度20 ug/kg 回收率% RSD% 回收率% RSD% 回收率% RSD% 1 雌三醇 88.6 4.30 91.9 0.90 98.7 2.42 2 17β-雌二醇 99.0 7.21 110.8 1.72 103.8 1.69 3 17a-雌二醇 102.5 6.81 97.3 5.31 98.9 2.41 4 炔雌醇 98.2 7.01 103.7 7.31 96.2 3.31 5 雌酮 97.4 3.63 100.9 1.86 91.5 1.05 6 己烯雌酚 81.9 5.59 87.7 6.97 93.3 2.85 7 己二烯雌酚 122.6 2.77 110.6 8.50 104.6 3.25 8 己烷雌酚 93.4 2.28 92.7 4.52 89.9 1.71 结论 依据国家标准《GB31658.9-2021动物性食品及尿液中雌激素类药物多残留的测定液相色谱-串联质谱法》，建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪测定牛奶中雌激素残留的方法。样品经酶解后用乙腈提取，固相萃取柱净化，三重四极杆质谱仪 LCMS-8045进行检测，内标法定量。8种雌激素在1 ug/L~200.0 ug/L浓度范围内线性良好，相关系数r均在0.999以上。加标浓度为1、5和20 ug/kg的样品，回收率在 81.9~122.6%之间。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于牛奶中雌激素的准确检测。 岛津应用云 依据国家标准《GB 31658.9-2021动物性食品及尿液中雌激素类药物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法》，建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪测定牛奶中雌激素残留的方法。样品经酶解后用乙腈提取，固相萃取柱净化，三重四极杆质谱仪LCMS-8045进行检测，内标法定量。8种雌激素在1 μg/L~200.0 μg/L浓度范围内线性良好，相关系数r均在0.999以上。加标浓度为1、5和20 μg/kg的样品，回收率在81.9~122.6%之间。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于牛奶中雌激素的准确检测。