牛奶中氮氨菲啶残留量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-063Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-456 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 使用 LCMS-8045 牛定牛奶中氮氨菲啶残留量 LCMSMS-456 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用测定牛奶中氮氨菲啶残留量的方法。结果表明：该方法在4 min 内完成对氮氨菲啶的检测。氮氨菲啶在20 ng/mL~1000ng/mL浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。此方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，且操作简单，可用于牛奶中氮氨菲啶残留量的快速检测。 氮氨菲啶 (isometamidium， ISM) 是目前国内外应用最广泛的治疗锥虫感染的药物之一。由于氮氨菲啶可有效抑制锥虫细胞内的 RNA 和 DNA聚合酶活性，干扰锥虫核酸的合成，常被用于牛羊等动物寄生虫病的预防和治疗。在养殖过程中，由于对治疗用量、使用次数和休药期认识不足或忽视，容易导致氮氨菲啶药物在动物可食性下游产品中残留，进而随着食物链进入人体，对公众的健康造成潜在威胁。近年来，食品安全问题引起了全社会的广泛关注，而兽药残留问题是影响动物源食品安全的主要因素之一。我国《GB31650-2019食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定：牛肉和牛奶中氮氨菲啶的最大残留限量值为100 pg/kg。 目前，国内外关于氮氨菲啶残留检测的报道较少，主要测定方法有高效液相色谱法(HPLC) 和高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS) 等。其中， LC-MS/MS 法具有很高的选择性和灵敏度，适合于复杂基体中的痕量物质分析，且准确度高。本文参照国家标准检测方法 GB 31660.8-2019《食品安全国家标准牛可食性组织及牛奶中氮氨菲啶残留量的测定》，采用乙腈和甲酸铵-甲醇溶液提取，正己烷脱脂，使用岛津超高效液相色谱与 LCMS-8045 质谱仪联用系统对牛奶中氮氨菲啶残留量进行测定。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于牛奶中氮氨菲啶残留量的快速测定。 实验部分 1.1仪器 本实验使用超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用系统。具体配置为LC-30AD×2输液泵， DGU-20A，在线脱气机， SIL-30AC自动进样器， CTO-20AC柱温箱，，CBM-20A系统控制器，LCMS-8045 三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： SHIMADZU Shim-pack GISS-HP C18 (50 mm×2.1 mml.D.，1.9 um) (P/N：227-30048-01) 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液；B相-0.1%甲酸乙腈溶液 流速： 0.50mL/min 进样体积：1uL 洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为B相20%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 3.00 Pumps Pump B Conc. 90 3.50 Pumps Pump B Conc. 90 3.60 Pumps Pump B Conc. 20 4.00 Controller Stop 质谱条件 离子源：ESI，正离子模式离子源接口电压：4.0 kV雾化气：氮气3.0 L/min干燥气：氮气10L/min加热气：空气10 L/min 脱溶剂管温度：250℃ 加热模块温度：400℃ 接口温度：300℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) MRM 参数：见表2 碰撞气：氩气 驻留时间：100ms 表2 MRM参数 化合物名称 CAS NO. 监测离子对 Q1 pre(V) CE Q3 Pre(V) 氮氨菲啶 4174-69-0 460.2>298.1* -34 -54 -22 460.2>313.1 -34 -45 -24 注：*表示定量离子对 1.3样品前处理方法 参考 GB 31660.8-2019《食品安全国家标准牛可食性组织及牛奶中氮氨菲啶残留量的测定液相色谱-串联质谱法》。 1.4基质标准溶液的配制 精密量取 10 pg/mL氮氨菲啶标准工作溶液适量，甲醇溶液溶解并稀释至2.0 mL，使氮氨菲啶浓度为20、50、100、250、500、1000 ng/mL，滤过，制成系列基质匹配标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。以定量离子峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。 结果与讨论 2.1标准样品的 MRM 色谱图 图1 氮氨菲啶基质匹配标准样品的 MRM 色谱图(20 ng/mL) 2.2线性范围与检出限 将不同浓度的氮氨菲啶基质匹配标准工作液，按1.2中的分析条件进行测定，使用外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图2所示。所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表3。 图2 氮氨菲啶校准曲线 表3 标准曲线与检出限信息 化合物 校准曲线 线性范围 准确度 定量限 检出限 (ng/mL) (ug/kg) (ug/kg) 氮氨菲啶 Y=(1320.94)X 0.9998 20~1000 90.2-102.5% 8 2.5 2.3精密度实验 对50 ng/mL、100 ng/mL 和 200 ng/mL 不同浓度的氮氨菲啶基质标准工作液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示：不同浓度样品中氮氨菲啶保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.24%~0.39%和0.80%~1.03%之间，仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果 (n=6) Conc.(ng/mL) RSD%(R.T.) RSD% (Area) 50 0.37 0.80 100 0.24 1.03 200 0.39 0.92 2.4回收率实验 称取空白牛奶样品，加入少量氮氨菲啶标准溶液，使加标浓度分别为10 ug/kg， 40 ug/kg 和 80 ug/kg。按照1.3样品前处理方法提取净化后，测定氮氨菲啶的加标回收率。空白牛奶样品 MRM 色谱图如3所示，10 ug/kg 加标样品 MRM 色谱图如4所示，加标回收率结果见表5。由结果可知，该方法灵敏度高，准确率好，可以满足国家标准检测方法 GB 31660.8-2019《食品安全国家标准牛可食性组织及牛奶中氮氨菲啶残留量的测定液相色谱-串联质谱法》检测要求。 1.54e4 图3 空白牛奶样品 MRM 图谱 图4 氮氨菲啶的加标样品MRM 图谱(10pg/kg) 表5氮氨菲啶的加标回收率结果(n=3) 名称 加标水平(ug/kg) 平均回收率% 氮氨菲啶 10 103.4 40 91.4 80 88.2 结论 采用 LC-MS/MS 法测定牛奶中氮氨菲啶残留量，具有定性定量结果准曲、灵敏度高的优点，在食品安全检测领域得到了越来越多的应用。本研究建立了一种使用岛津超高效液相色谱 LC-30A和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用测定牛奶中氮氨菲啶残留量的方法。该方法使用 Shim-pack GISS C18 色谱柱，在 4min 内完成对氮氨菲啶的检测。氮氨菲啶在 20 ng/mL~1000 ng/mL浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，且操作简单，可用于牛奶中氮氨菲啶的快速分析。 岛津应用云 建立了一种使用岛津超高效液相色谱LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用测定牛奶中氮氨菲啶残留量的方法。该方法使用Shim-pack GISS C18色谱柱，在4min内完成对氮氨菲啶的检测。氮氨菲啶在20 ng/mL~1000 ng/mL浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，且操作简单，可用于牛奶中氮氨菲啶的快速分析。