土壤中烷基汞检测方案(液相色谱仪)

北京北分瑞利分析仪器(集团)有限责任公司 液相色谱-原子荧光联用法检测土壤中的烷基汞 编制人员： 北分瑞利 摘要 甲基汞是毒性最强的汞化合物，主要侵害中枢神经系统，能造成严重的语言和记忆力障碍，甚至使神经细胞基因表达异常。无机汞毒性相对较弱，但无机汞进入环境后，在微生物为主的多种环境因素下甲基化形成甲基汞，然后甲基汞毒性入侵食物链在高等动物体内累积富集放大，危害人体健康。汞的富集也会产生植物毒性，通过与植物酶的活性中心硫元素结合，从而影响酶的活性，进而影响植物的生长，严重情况下可以导致植物枯萎死亡。因此也促进了汞在土壤及植物中的毒性浓度界限方面的研宄。 本文介绍了用二氯甲烷将水相中烷基汞萃取至有机相后再经L-半胱氨酸和乙酸铵反萃取，经液相色谱柱分离后依次进入在线紫外消解装置、原子荧光系统石英原子化器继而被检测到。与传统的气相色谱系统相比，大大降低了四丙基硼化钠等材料的成本，且前处理过程对实验室仪器设备要求较低， 在本文规定的使用条件下测定样品中甲基汞、乙基汞的含量，使用其峰面积进行计算。方法在0.2~10 ug/L 的浓度范围内标准曲线的线性相关系数R在0.999以上，方法回收率和重复性高。 前言 1.1 烷基汞的危害 汞在自然中按存在形态可以分为单质汞、无机汞和有机汞三种形态，不同形态的汞，其毒性相差也很大，其中甲基汞是毒性最强的汞化合物。自然界中本身就存在汞元素，，自然汞矿由于不可控因素如地壳运动、森林火灾、火山喷发等自然活动导致汞暴露在环境中，进而通过水、土壤、大气发生迁移转化。 汞在大气中的主要存在形式为颗粒态汞、、气态单质汞和活性气态汞；土壤中的汞由很大部分是大气汞沉降，土壤对汞有很好的吸附能力，汞与土壤胶体、有机质等结合，大大降低了其在土壤中的活性，而土壤中会有很少部分的汞会挥发到大气中，土壤中的汞在微生物、植物和光照作用下发生甲基化和去甲基化的转化；地表径流是土壤中汞迁移到水环境中的主要方式。 土壤汞污染逐渐成为关注热点，从其污染特性，污染持久，易转化为剧毒物质甲基汞，进入大气并长期存在，随大气迁移造成全球性污染。大气沉降是土壤汞污染的主要因素，大气汞不断增加，，土壤汞污染情势严峻，因此，越来越多人进行土壤汞污染研究。目前的人为来源导致每年约有30%的汞排放到空气中。另外10%来自天然地质资源，其余来自先前释放的汞的“再排放”，这些汞已经在土壤表面和海洋中积累了数十年和数百年。虽然这种再释放汞的原始来源无法确定，但自工业化开始以来人为排放量大于自然排放量这一事实。 中国作为世界上汞污染物排放量最大的国家，有色金属，炼金等行业中大量的使用汞，并产生大量的汞污染物，缺乏妥善的处置，使汞污染对人们的健康生活造成巨大的威胁。汞污染具有持久性，不可降解性，，且易挥发，以及生成有机金属化合物，容易在水体、大气和土壤环境中迁移转化使其污染产生不确定性，同时这些汞会通过土壤-植物-动物等体系入侵到食物链，最后会造成汞毒性的积累和放大。土壤环境复杂，汞的积累会对植物产生毒害效应，对农作物和蔬菜的毒害效应也收到关注和研究，土壤汞污染的植物效应研形也是当今的焦点和难点。 1.2 烷基汞的检测方式 目前烷基汞的检测方法主要包括气相色谱法及其联用技术、液相色谱法及其联用 技术，原子荧光光谱法及其联用技术。 其中气相色谱法是我国在分析烷基汞中比较早也比较成熟的方法之一，气相色谱主要采用电子捕获检测器(ECD)进行测定。然而，使用 ECD 测定存在灵敏度低、选择性差和色谱柱反应等问题，而且 ECD 只对含电负性的化合物敏感，并非直接测定汞元素，样品中如有电负性物质容易产生干扰。 与气相色谱法相比，高效液相色谱法具有精密度较高的优点、其样品回收相对比较简单、高沸点的化合物和热不稳定化合物的分离不需经过衍生化过程等优点。目前，在检测烷基汞的方法中液相色谱联用技术中 HPLC-ICP-MS 法较为常见，该技术具有前处理过程简单、仪器操作方便、灵敏度高、检出限低等优点，但采购和维护成本较高，无法匹配中小型实验室。 原子荧光光谱法因为其原理上的优势，相较于气相色谱法和液相色谱法，其对于汞的灵敏度更高、受到基质干扰程度更小、检出限更低等优点，也使原子荧光光谱法在烷基汞测定中运用最为广泛。因此，液相色谱-原子荧光联用检测技术采用液相色谱系统的分离能力，并结合原子荧光检测系统的高灵敏度，能够发挥各自的优点，使烷基汞得检测更高效、更准确。 1.3 环境中烷基汞的分析方法标准 目前，我国涉及到烷基汞(甲基汞)的检测标准包括2项国家标准、3项行业标准和8项地方标准。其中，国家标准有《水质烷基汞的测定气相色谱法》GB/T 14204-93)和《环境甲基汞的测定气相色谱法》(GB/T 17132-1997)这两项；行业标准有《水质烷基汞的测定吹扫捕集/气相色谱-冷原子荧光光谱法》(HJ977-2018)、《出口水产品中甲基汞和乙基汞的测定液测色谱-电感耦合等离子体质谱法》(SN/T 4851-2017)和《出口水产品中无机汞、甲基汞和乙基汞的测定液相色谱-原子荧光光谱联用(LC-AFS)法》(SN/T3034-2011)；地方标准有广地省地方标准《水产品中甲基汞的测定气相色谱法》(DB44/T318-2006)、福建省地方标准《环境样品中甲基汞、乙基汞及无机汞高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)测定》(DB 35/T895-2009)、陕西省地方标准《水质烷基汞的测定液相色谱-原子荧光串联法》 (DB61/T562-2013)、吉林省地方标准《废水烷基汞的测定液相色谱-原子荧光法》((DB22/T 2205-2014)、《水中甲基汞的测定液相色谱-原子荧光法》((DB22/T 2464-2016) 和《农田土壤中甲基汞、乙基汞的测定高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法》(DB22/T 1586-2018)、河南省地方标准《水质甲基汞和乙基汞的测定 HPLC-ICP-MS法》(DB41/T 1169-2015)、新疆维吾尔自治区《水质甲基汞和乙基汞的测定液相色谱-原子荧光光谱法》 (DB65/T 4367-2021)。 2适用标准 参照标准《水质烷基汞的测定液相色谱-原子荧光法》，该标准还在评审阶段，尚未发行，后续将陆续发行土壤和固废的适用标准，采用液液萃取-液相色谱-原子荧光法测定土壤中烷基汞的含量。 3测试原理 土壤中的烷基汞在超声波条件下被硝酸溶液提取出来，经二氯甲烷萃取后，用L-半胱氨酸-乙酸铵反萃取，反萃取液中的甲基汞和乙基汞经液相色谱分离，然后被氧化剂氧化，在紫外灯的照射下，将甲基汞和乙基汞转化为无机汞，无机汞被还原剂还原为汞原子，在汞空心阴极灯照射下，汞原子发射出特征波长的荧光，其荧光强度与汞的含量成正比。根据保留时间定性，外标法定量。 4 仪器设备 4.1 仪器配置 液相色谱-原子荧光联用仪：由液相色谱系统、在线紫外消解装置及原子荧光光谱仪组成。 色谱柱：填料粒径为5um， 柱长15 cm， 内径4.6 mm 的 C18反相色谱柱，或其它等效色谱柱。 汞空心阴极灯。 分液漏斗：125ml、500 ml。 一般实验室常用仪器和设备。 4.2 试剂耗材 标准溶液：氯化甲基汞、氯化乙基汞浓度为 1000 ug/mL，溶剂为甲醇(AccuStandardInc 公司)； 盐酸(HC1)：： p=1.18 g/ml，优级纯。 氯化钠(NaCl)：优级纯。 氢氧化钾(KOH)：优级纯。 L-半胱氨酸 (C3H7NO2S)：生化试剂。 乙酸铵(CH3COONH4)：优级纯。 硼氢化钾(KBH4)，分析纯。 过硫酸钾(K2S2O8)，分析纯。 无水硫酸钠 (Na2SO4)：使用前在400℃下灼烧4h，冷却后，于磨口玻璃瓶中密封保存。 甲醇(CH3OH)：液相色谱纯。 二氯甲烷(CH2Cl2)：农残级。 滤膜：：(0.45 um 醋酸纤维滤膜。 氩气：纯度≥99.999%。 5测试方法 5.1 测试条件 5.1.1 液相色谱系统测试条件 液相色谱采用等度分离，流动相：100%流动相，流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样体积：100u1. 5.1.2 在线紫外消解条件 蠕动泵1泵速：45r/min，；消解液蠕动泵2泵速： 50r/min。 5.1.3 原子荧光测试条件 开启仪器，待预热稳定后，按照仪器操作说明书要求调节仪器至最佳工作状态。参考测量条件见表1。 表1 原子荧光参考测量条件 负高压(V) 灯电流(mA) 原子化方式 原子化器温度(℃) 载气流量(ml/min) 积分方式 280~320 30~50 冷原子法 200 400~700 峰面积 5.2 测试过程 5.2.1 试剂配制 盐酸溶液：1+19。 还原剂：称取2.0g氢氧化钾，用水溶解后，加入5.0g硼氢化钾，混匀，用水定容至1L。临用现配。 氧化剂：称取5.0g氢氧化钾，用水溶解后，加入20.0g过硫酸钾，混匀，用水定容至1L。临用现配。 反萃取液：称取1.0gL-半胱氨酸和0.8g乙酸铵，用水溶解后定容至100 ml。临用现配。 流动相：：7称取1.2gL-半胱氨酸和 0.62 g 乙酸铵，用水溶解后转移至1000 ml容量瓶中，再加入80ml甲醇，最后用水定容至标线，经滤膜过滤后使用。临用现配。 5.2.2 标准曲线的制备 取适量的混合标准使用液，用反萃取液稀释，配置6个浓度点的标准样品，使其烷基汞的浓度分别为 0.200 ug/L、0.500 ug/L、1.00 ug/L、2.00 pg/L、5.00 ug/L、10.0ug/L，待测。 5.2.3 样品制备 5.2.3.1提取 准确称取5.0g(精确到0.1g)土壤或固废样品，放入50 ml离心管中，加入20 ml4 mol/L 硝酸盖紧盖子并混匀，360 W超声萃取 10min 后，5000 r/min 离心10min，将上清部分硝酸萃取液转移至另一50ml离心管中；然后再向样品中加入20 ml 4 mol/L硝酸萃取1次，将两次上清液合并并混匀，待萃取。 5.2.3.2萃取 准确量取 20 ml 硝酸提取液至500 ml分液漏斗中，加纯水定容至250ml， 加入10g氯化钠，溶解后摇匀。加入30ml二氯甲烷，振摇10 min 萃取，静置10 min， 待两相分层后，收集有机相于锥形瓶中。再用40ml二氯甲烷分两次重复上次萃取操作，将三次有机相合并于锥形瓶中，加入适量无水硫酸钠进行脱水。将有机相转移至125 ml分液漏斗中，并用少量二氯甲烷多次涮洗锥形瓶后一并转移至分液漏斗。加入3ml反 萃取液振摇反萃取 5 min， 静置10 min， 待两相分层后弃去有机相，水相经滤膜过滤后，置于样品瓶中，6h内完成分析。 5.3 测试结果 5.3.1 测试谱图 1mV 图1烷基汞测试谱图 表格1组分名称及保留时间 序号 中文名称 保留时间(min) 表格2曲线数据 表格2曲线数据 组分 浓度 (ug/L) 序号 相关系数 峰面积 0.20 0.50 1.00 2.00 5.00 5.3.2定量及定性重复性、准确性 对甲基汞(75±4) ng/kg 的标准土壤样品进行重复6次前处理，并依次进样，测试甲基汞的定性和定量重复性、准确性，测试结果见表3和表4，定性重复性均在1%以内，定量重复性在5%以内，基本满足要求。 表格3定性重复性测试数据 保留时间(min) RSD (%) 1 2 3 4 5 6 平均值 3.116 3.128 3.128 3.136 3.129 3.132 3.128 0.21 表格4定量重复性测试数据 甲基汞浓度含量(ug/kg) 甲基汞浓度含量(ug/kg) RSD (%) 1 2 3 4 5 6 平均值 78.33 78.96 71.01 74.89 77.16 74.03 75.73 3.97 5.3.1 方法回收率 取空白石英砂 5.0g，分别添加 0.5 u g/L 的甲基汞和乙基汞混合标准溶液，形成高、中、低不同水平的加标样品，每个水平平行测定6份，按照上述步骤进行前处理，计算回收率和重复性，0.5 n g/L 加标样品见下表5、表6，其他加标含量(2ug/L、8ug/L)重复性及回收率详见汇总表7. 表格50.5mg/L甲基汞回收率和重复性 名称 含量 ug/L 回收率/% 5#样品1 0.4769 95.4 5#样品2 0.4031 80.6 5#样品3 0.4944 98.9 5#样品4 0.4681 93.6 5#样品5 0.5488 110 5#样品6 0.4622 92.4 表格 620pg乙基汞回收率和重复性 名称 含量 ng/L 回收率/% 5#样品1 0.4052 81.0 5#样品2 0.3593 71.9 5#样品3 0.3871 77.4 5#样品4 0.4466 89.3 5#样品5 0.3970 79.4 5#样品6 0.4220 84.4 表格7甲基汞和乙基汞的回收率和重复性 名称 回收率/% 重复性/% 回收率% 重复性/% 甲基汞 92.5 3.46 90.2 3.40 乙基汞 84.5 4.95 79.8 4.51 6：结论 本文采用液液萃取-液相色谱-原子荧光联用法(LC-AFS)测定土壤中的烷基汞，该方法前处理通过利用二氯甲烷对烷基汞进行萃取，再利用L-半胱氨酸中的巯基对汞原子的络合作用从而对烷基汞进行反萃取，通过 C18 色谱柱进行分离，过硫酸钾将汞的各形态进行在线紫外消解全部生成无机汞离子，从而可以被原子荧光光谱仪检测到。 第页共页 1   测试原理土壤中的烷基汞在超声波条件下被硝酸溶液提取出来，经二氯甲烷萃取后，用L-半胱氨酸-乙酸铵反萃取，反萃取液中的甲基汞和乙基汞经液相色谱分离，然后被氧化剂氧化，在紫外灯的照射下，将甲基汞和乙基汞转化为无机汞，无机汞被还原剂还原为汞原子，在汞空心阴极灯照射下，汞原子发射出特征波长的荧光，其荧光强度与汞的含量成正比。根据保留时间定性，外标法定量。