牛奶中青霉素类检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RKFT-F005 解决方案 牛奶中青霉素类化合物的检测 关键词 全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；；青霉素类化合物 介绍 青霉素类化合物属于β-内酰胺类抗生素中的一类，分为天然青霉素和半合成青霉素，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用，广泛用于预防和治疗动物疾病。青霉素在食品中的残留会对青霉素过敏的人产生健康危害，更为重要的是，青霉素被过量摄入人体中容易破坏健康人的正常菌群环境，导致人体免疫力降低。 本方案参考《GB/T 22975-2008牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和双氯西林残留量的测定液相色谱-串联质谱法》 ，采用75%乙腈水溶液对目标化合物进行提取，提取液用HLB柱经睿科Fotector Plus全自动固相萃取仪进行净化，高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量，整个检测结果具有良好的平行性与准确性。 1.仪器与耗材 仪器和耗材 睿科Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪 睿科MPE 真空平行浓缩仪 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260，质谱检测器((MS) Agilent 6410 HLB 固相萃取柱 (RayCure， 500mg/6mL，货号：RC-204-36477) 甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)、超纯水 75%乙腈水溶液：取300mL 乙与100mL 水混合 0. 1mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH=8.0)：准确磷取磷酸氢二钠 6.0g 溶解于 450mL水中，用氢氧化钠溶液调节pH值=8，加水至500mL 2.样品制备及前处理 2.1提取 准确称牛奶4.0g于50mL离心管中，加入20mL 75%乙腈水溶液，涡旋提取2.0min，于离心机上以4000rpm的转速离心10min。转移上清液至MPE浓缩杯，再用10mL 75%乙腈水溶液提取一次，合并上清液于同一浓缩杯中。在45℃条件下用 MPE 浓缩至约7mL， 加入 2mL磷酸盐缓冲液混匀，转移到玻璃上样管中，待净化。 2.2固相萃取净化条件 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Fotector Plus 固相萃取柱 HLB 柱(RayCure， 500mg/6mL) 活化 甲醇，超纯水，0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液 淋洗 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液，超纯水 洗脱 75%乙腈水溶液 2.3固相萃取净化 分别以6mL 甲醇、6mL水和5mL 磷酸盐缓冲液活化 HLB柱，将上述样品溶液以2.5mL/min 的速度进行上样，用2mL 磷酸盐缓冲液清洗样品瓶2遍，再用3mL水淋洗柱子，然后用气推的方式推干柱子。最后以4mL 75%乙腈水溶液洗脱标标化合物，收集洗脱液(具体方法设置见图1)。用超纯水将洗脱液定容至4.0mL，涡旋混匀，过滤膜上机检测。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间min 1 清洗样品通道 甲醇 2.8 2 活化 甲醇 有机废液 3 6 2.5 3 活化 水 废水 3 6 2.5 4 活化 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 废水 3 5 2.1 5 上样 废水 2.5 10 4.8 6 清洗样品瓶 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 废水 60 2 1.5 7 清洗样品瓶 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 废水 60 2 1.5 8 淋洗 水 废水 3 3 1.4 9 气推 废水 80 30 2.2 10 清洗注射泵 75%乙腈水溶液 60 4 0.5 11 洗脱 75%乙腈水溶液 收集 4 2.4 12 气推 收集 2 2 1.4 13 气推 收集 20 10 1.3 14 结束 15 图-1 Fotector Plus 固相萃取净化方法 3.检测条件 3.1 色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5umx21 mmx50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A：0.1% formic acid， B： Methanol 柱温 30°C 进样体积 10 uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI+ 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-6.0 min， 80%流动相A； 6.01-8.0 min， 20%的流动相A； 8.01-10.0 min，80%流动相A 保持2 min 3.2 MRM 参数 Compound 化合物 Prec Ion 母离子 Prod Ion 子离子 Dwell (ms) 驻留时间 Frag (V) 裂解电压 CE(V) 碰撞能量 双氯西林 470 310.9 22 110 13 160* 22 110 9 氯唑西林 436 277* 22 100 10 160.1 22 100 9 奈夫西林 415 256* 22 110 14 160 22 110 13 苯唑西林 402.1 243* 22 110 9 160 22 110 9 阿莫西林 366.1 349.2* 22 70 4 113.7 22 70 19 青霉素Ⅴ 351.1 160* 22 80 8 113.9 22 80 39 氨苄西林 350.1 160.1 22 90 11 106.1* 22 90 19 青霉素G 335.1 175.9 22 100 12 160.1* 22 100 14 哌拉西林 518.1 142.9 22 90 34 160.1* 22 90 12 注：带“*”22白的为定量离子对 4.样品测试 4.1基质效应验证 为了消除基质带来的离子抑制对定量测定的影响，需要用空白样品按照上述前处理操作制备空白基质液，然后稀释一系列浓度标准品，制备基质工作曲线。 4.2 样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向空白牛奶样品(4g)中加入上述9种青霉素类标准品，添加水平为10 n g/kg 进行加标回收验证。测试结果如表-2所示，9种青霉素类的回收率在73%-95%之间， RSD 值小于10%。说明该方法能够很好地用于牛奶样品中9种青霉素类抗生素的检测。 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.，Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2021年10月版 网址：www.raykol.com热线：箱： info@raykol.com 网址：：Vwww.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 青霉素类化合物属于β-内酰胺类抗生素中的一类，分为天然青霉素和半合成青霉素，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用，广泛用于预防和治疗动物疾病。青霉素在食品中的残留会对青霉素过敏的人产生健康危害，更为重要的是，青霉素被过量摄入人体中容易破坏健康人的正常菌群环境，导致人体免疫力降低。本方案参考《GB/T 22975-2008牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和双氯西林残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》 ，采用75%乙腈水溶液对目标化合物进行提取，提取液用HLB柱经睿科Fotector Plus全自动固相萃取仪进行净化，高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量，整个检测结果具有良好的平行性与准确性。关键词：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；青霉素类化合物