啤酒中异α-酸、α-酸和葎草灵酮检测方案(液相色谱仪)

No.L590News ApplicationnNo.L5902*表示异a-酸的trans体，2表示cis体 http：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2020年12月400-650-0439 高效液相色谱分析仪 NexeraTM XR 啤酒中异a-酸、α-酸和葎草灵酮的快速分析和多数据报告的应用 森田Azusa 对用户的好处 ◆使用快速分析条件，每次分析时可在约5分钟内分析啤酒中的异α-酸、α-酸和葎草灵酮。 ●利用 LabSolutions 的多数据报告功能，无需手动转录数据即可自动输出定量值和图形。 |前言 异α-酸是啤酒中含有的苦味成分，是在酿造工序中对啤酒花中包含的a-酸加热并使其异构化而生成的。另外，葎草灵酮也是苦味成分，通过α-酸过氧化作用而生成。 在符合 EBC的条件下，制备流动相时需要使用 pH计，但在快速分析条件下，无需使用 pH 计即可制备流动相。在符合 EBC9.47的条件下，每次分析的分析时间为45分钟，而在快速分析条件下，分析时间为5分钟，缩短了约90%。为了改善异a-酸的峰形，在快速分析条件的流动相中添加了 EDTA。 测定苦味值通常采用国际苦味单位(IBU； InternationalBitterness Units)。该方法对啤酒中的苦味成分进行溶剂萃取，使用分光光度计测定异α-酸最大波长附近275 nm 处的吸光度并进行计算。虽然这种方法很方便，但是如果样品中含有在275nm 处有 UV吸收的物质，则可能得到一个过高的值。 HPLC可以利用色谱柱分离后测定组分吸光度，因此，可以更准确地定量各组分。 本文介绍了通过高效液相色谱仪 Nexera XR 参考 EBC(European Brewery Convention) 9.47中的方法，同时分析啤酒中异a-酸、α-酸和葎草灵酮的案例。使用紫外可见分光光度计UV-1900i 对 IBU 进行实际测定，并与 HPLC 的结果进行了比较。此外，还介绍了快速分离条件和 LabSolutions 多数据报告的应用。 图2符合EBC 9.47 的条件下的标准溶液色谱图 |异α-酸、α-酸和葎草灵酮标准溶液的分析 啤酒中所含的异α-酸、α-酸和葎草灵酮的结构式如图1所示。异α-酸、α-酸和葎草灵酮分别存在3个同系物。另外，异α-酸还具有顺反异构体。用于制备标准溶液的试剂使用了“DCHA-Iso， ICS-I4”、“International Calibration Extract 4”、“DCHA-Humulinones， ICS-Hum1”。各试剂的成分如表1所示。将各试剂溶解在添加有磷酸的甲醇中以制备母液，进一步利用流动相稀释并进行制备(图4)。图2所示为符合 EBC 9.47 的标准溶液的色谱图，图3所示为在快速分析条件下分析的标准溶液的色谱图。由于用于制备标准溶液的试剂本身包含多个同系物，因此，此处分别对异α-酸、α-酸和葎草灵酮进行了分组。 图3快速分析条件下标准溶液的色谱图 R H R H1HO HOw OH O人R HOR HO'OHHO 0OOHOH0 HO` 0 反式异α-酸 顺式异α-酸 a-酸 葎草灵酮 反式异葎草酮 R=CH，CH(CH3)2 顺式异葎草酮 R=CH，CH(CH3)2 反式异合葎草酮 R=CH(CH，)2 顺式异合葎草酮 R=CH(CH3)2 葎草灵酮 R=CH，CH(CH3)2 葎草灵酮 R=CH，CH(CH，)2类葎草灵酮 R=CH(CH；) 类葎草灵酮 反式异加葎草酮 R=CH(CH，)CH，CH， 顺式异加葎草酮 R=CH(CH，)CH，CH 近葎草灵酮 R=CH(CH，)CH，CH， R=CH(CH；)2近葎草灵酮 R=CH(CH，)CH，CH， 反式异α-酸 顺式异α-酸 反式异葎草酮 R=CH，CH(CH3)2 顺式异葎草酮 R=CH，CH(CH3)2 反式异合葎草酮 R=CH(CH，)2 顺式异合葎草酮 R=CH(CH3)2 反式异加葎草酮 R=CH(CH，)CH，CH， 顺式异加葎草酮 R=CH(CH，)CH，CH 图1异α-酸、α-酸和葎草灵酮的结构式 表1用于制备标准溶液的试剂 试剂名 成分 DCHA-Iso， ICS-I4 总异a-酸65.2%(仅反式异构体) 国际校准提取物4 类葎草灵酮10.98%N+近葎草灵酮31.60%总a-酸42.58% 类葎草灵酮13.02%N+近葎草灵酮13.52%总β-酸26.54% DCHA-葎草灵酮， ICS-Hum1 葎草灵酮65.6% 任何试剂均由 ASBC (American Society of Brewing Chemists) 或 LaborVeritas 生产。ICS-I4仅包含反式体。 由于标准溶液中所含的β-酸(合葎草灵酮、葎草灵酮、加葎草灵酮)在α-酸之后洗脱，因此，在各分析条件下都追加了强洗脱力溶剂(MobilePhase B) 的清洗程序。 表2符合EBC9.47的分析条件 系统 ： Nexera XR 色谱柱* ： Shim-packTM GIST C8 (250 mm×4.6 mm 内径， 5 um) 流动相A ：乙乙/1%柠檬酸缓冲液 (pH7.0)=30：70 流动相B ：甲醇 流速 ：1.0 mL/min 时间程序 ：B浓度15%(0-5min) -80% (30-33 min)- 15%(35-45min) 柱温 ：35℃ 进样量 ：50pL 检测波长 ： UV 270 nm 样品瓶 ：岛津样品瓶，LC， 1.5 mL透明玻璃 标准溶液的稀释溶液*3：乙腈/1%柠檬酸缓冲液(pH 7.0)=50：50 (v/v) 表3快速分析条件 系统 ： Nexera XR 色谱柱 ： Shim-pack Velox C18 (50 mm×3.0 mm 内径， 1.8um) 流动相A ：10mmol/L(钠)磷酸盐缓冲液 (pH2.6) +0.2 mmol/L ETDA 2Naaq. 流动相B ：乙腈 流速 ·0.8mL/min 时间程序 ：B浓度.40%(0min) -90%(2.1-3.5 min)- 40%(3.51-5 min) 柱温 ·40℃ 进样量 ：5pL 检测波长 · UV270nm 样品瓶 ：岛津样品瓶， LC， 1.5 mL 透明玻璃 标准溶液的稀释溶液*5：流动相A/流动相 B=50：50(v/v) 异α-酸、α-酸和葎草灵酮标准溶液的重现性 表4所示为对按照图4制备的标准溶液反复分析5次时的面积的相对标准偏差。在任何分析条件下，均得到了相对标准偏差小于等于1%的良好结果，表明系统性能稳定。 表4重复分析5次时的标准溶液峰面积的相对标准偏差(%RSD) 分析条件 葎草灵酮 异α-酸 α-酸 根据 EBC 9.47 0.04 0.19 0.28 快速分析 0.03 0.03 0.03 啤酒样品的分析 参考 EBC 9.47， 对市售的5种啤行进行了预处理。各样品详情如表5所示，预处理方法如图5所示。图6所示为基于EBC 9.47的定量值计算方法，图7所示为依据EBC 9.47且在快速分析条件下测定各样品时的色谱图。 表5待测定样品的种类 样品 啤酒类型 生产国 啤酒 贮藏啤酒 日本 啤酒Ⅱ 贮藏啤酒 美国 啤酒Ⅲ 贮藏啤酒 意大利 啤酒IV 麦芽酒 日本 啤酒V IPA (印度淡啤酒) 日本 图5啤酒的预处理方法 F=Astdx 50 x 100 / (VstdxVinj xMstd x Cstd/100) 式中： F=响应因子(4次进样平均值)(每毫克面积) Astd=标准品中代表特定类型的异a酸的总峰面积 Mstd=国际校准标准品的重量，单位为mgCstd=国际校准标准中特定类型的异a酸的浓度，单位为%(m/m) Vstd=以50mL稀释的标准储备液(mL)的体积(工作标准溶液) Vin=进样量，单位为mL Cs=As xDx1000/(Vinjx F) 式中： Cs=啤酒中特定类型的异a酸的浓度，单位为mg/L As=样品中代表特定类型的异a酸的总峰面积(两次进样的平均值) F=响应因子，每毫克面积 D=稀释系数=2×0.967=1.934， 其中0.967为将甲醇和啤酒按1：1体积比 混合时的体积变化。 News 图7啤酒的色谱图 表6定量结果(符合EBC9.47 的条件) 表7定量结果(快速分析条件) 单位： mg/L 单位： mg/L 样品 葎草灵酮 异a-酸 a-酸 啤酒| 1.0 23.0 0.7 啤酒Ⅱ 0.4 8.0 0.0 啤酒Ⅲ 1.5 19.4 1.1 啤酒 IV 7.5 22.1 4.3 啤酒V 17.1 40.1 18.6 样品 葎草灵酮 异a-酸 a-酸 啤酒| 1.2 21.0 0.7 啤酒Ⅱ 0.6 7.0 0.1 啤酒Ⅲ 1.3 18.2 0.9 啤酒IV 6.4 19.7 3.6 啤酒V 14.9 36.8 18.7 样品 IBU 啤酒| 16.3 啤酒Ⅱ 5.1 啤酒Ⅲ 14.1 啤酒 IV 23.6 啤酒V 50.5 根据图6的计算公式对啤酒中的异α-酸、α-酸和葎草灵酮进行了定量。各分析条件下的结果如表6、表7所示。在任何条件下均能得到几乎相同的定量值。此外，表8所示为根据METHODS of the ASBC， Method Beer-23，利用紫外可见分光光度计 UV-1900i 实际测定 IBU的结果。关于 IBU测定条件的详细内容，请参照应用报告 NO.A622。 在Beer V的IPA(印度淡啤酒)中，IBU的值很高。IPA的特点是，使用大量啤酒花所以具有独特的苦味，主要原因是由于在煮沸并冷却的麦汁中也添加了啤酒花，因此与其他啤酒相比，a-酸和葎草灵酮增加。 以与标准溶液相同的浓度进行标准添加，进行5次图5所示的预处理，并计算了加标回收率。表9所示为加标回收率，表10所示为添加样品5点峰面积的相对标准偏差。 表9加标回收收验结果(在高速分析条件下测定， n=5 的平均) 单位：% 样品 葎草灵酮 异a-酸 a-酸 啤酒| 108 105 103 啤酒Ⅱ 115 115 111 啤酒Ⅲ 112 109 95 啤酒 IV 105 103 94 啤酒V 106 104 103 表10加标样品的峰面积相对标准偏差(在高速分析条件下测定， n=5) 单位：% 样品 葎草灵酮 异a-酸 a-酸 啤酒| 1.69 1.60 2.12 啤酒Ⅱ 1.07 1.48 1.45 啤酒Ⅲ 2.60 1.54 3.27 啤酒IV 1.60 1.83 1.63 啤酒V 0.93 0.85 0.80 *7：多数据报告是 Lab Solutions DB 以及 CS 的可选功能。 Nexera、Shim-pack 、LabSolutions 是岛津制作所式会社在日本及其他国家的商标。 多数据报告*的应用 多数据报告是 LabSolutionsTMDB 以及 CS 的可选功能，可以创建灵活性较高的报告。可与分析日程表关联，在分析结束的同时创建报告。不仅可以减少手动编写报告的时间，还可以防止转录错误。 准备了一个模板，其中包含图6所示的用于定量的计算公式，并根据啤酒中的异a-酸、α-酸和葎草灵酮的测定结果创建了多数据报告。同时还可以根据定量结果同时创建图表，因此，一眼就能判别苦味组分的比例(图8)。 图8利用多数据报告 自动计算啤酒中的异α-酸、α-酸和葎草灵酮 总结 本文介绍了一种使用 Nexera XR分析啤酒中异a-酸、α-酸和葎草灵酮的案例。在符合 EBC 9.47的条件和快速分析这两种条件下进行分析，定量值几乎相同。在快速分析条件下，每个分析都可以在5分钟内完成，分析时间可以减少约90%。利用 UV-1900i 测定 IBU 与 HPLC 的结果进行了比较，结果发现，印度淡啤酒中的IBU较高。采用高效液相色谱法可以进行更准确的定量分析。利用多数据报告，能够自动创建图表和 岛津应用云 定量值列表，而无需将复杂的计算公式转录到 ( 表格计算软件中。 ) ( 参考文献 ) ( 1 ) American Society of Brew i ng Chemists， ASBC Methods of Analysis， Beer-23 ) ( 2 ) European B rewery Convention， EBC A N ALYTICA， 9.47 ) 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 本文介绍了一种使用Nexera   XR分析啤酒中异α-酸、α-酸和葎草灵酮的案例。在符合EBC   9.47的条件和快速分析这两种条件下进行分析，定量值几乎相同。在快速分析条件下，每个分析都可以在5分钟内完成，分析时间可以减少约90％。利用UV-1900i测定IBU与HPLC的结果进行了比较，结果发现，印度淡啤酒中的IBU较高。采用高效液相色谱法可以进行更准确的定量分析。利用多数据报告，能够自动创建图表和定量值列表，而无需将复杂的计算公式转录到表格计算软件中。