医药中间体中分离纯化检测方案(制备液相色谱)

大极性组分的制备救星—亲水作用色谱HILIC 目前对大极性化合物的研究在医药、天然产物、生化、食品安全等方面的应用逐渐提升，对大极性化合物的纯化需求也越来越多。然而在色谱纯化中，最常用的反相模式对大极性组分的纯化有自己的短板——保留太弱，而亲水作用色谱（HILIC）则弥补了反相色谱的缺点，它可提高对极性物质的保留从而获得满意的纯化效果。 HILIC的应用模式与正相色谱很相似，其保留强度与溶质极性成正比，与流动相极性成反比。其保留机制是液-液分配、吸附作用、离子交换等多种作用组合，从而使HILIC与反相相比有独特的选择性。HILIC固定相是极性组分，可吸附极性溶剂和水相使固定相表面形成极性亲水层，基于相似相容的原理，则极性样品会与固定相相互作用，从而增加保留，所以流动相至少要含有3%的极性溶剂，这样才能在固定相表面形成亲水层。 HILIC条件下，常用的流动相体系是乙腈和水，水作为强溶剂，乙腈作为弱溶剂，某些情况下如果水相洗脱能量太强，可用极性有机溶剂代替部分水相可增加保留时间，但不可用甲醇、乙醇等极性醇类完全替换乙腈，否则会导致保留时间不充分。常用的固定相有未衍生化硅胶或杂化颗粒、酰胺基、氨基、二醇、两性离子等，其中未衍生化的硅胶应用比较广泛，尤其是应用于药物分析和纯化方面。 实验部分 ⑴ 样品信息 待纯化样品来源于某制药公司，样品极性很大同时要求在色谱柱中有合适的保留时间，制备量在50mg左右。 ⑵ 制备参数 取50mg粗品溶于溶剂中，超声直至澄清状态，用注射器将溶解后的样品打进色谱柱中，具体实验参数如表1所示： 表1. 样品的制备参数设置 仪器 SepaBean machine T 分离柱 键合相系列快速分离柱，40g球形C4键合硅胶柱，20-45μm，100Å (订货号：SW-5422-40-SP) 键合相系列快速分离柱，25g 超纯无定形NH2键合硅胶，40-63μm，60Å (订货号：SW-5501-25-IR) 流动相 A：水 B：乙腈 A：乙腈 B：水 进样量 50mg样品溶于1ml水 50mg样品溶于1ml乙腈 流速 30ml/min 20ml/min 波长 254nm；220nm 梯度 时间/min 溶剂B% 时间/min 溶剂B% 0 0 0 0 18 0 10 20 25 10 15 20 ⑶ 案例小结 根据图1和图2可以看出，样品组分在C4反相柱上不保留，在氨基柱上应用HILIC模式时不仅保留时间增加，三个组分ABC都达到了基线分离。 图1. 样品在C4色谱柱下的Flash分离谱图 图2. 样品在氨基柱下的Flash分离谱图 结果与讨论 图3. 氨基柱固定相表明键合功能基团示意图 氨基柱是由极性基团氨丙硅烷基键合在硅胶上制成的极性键合相色谱柱（参见图3），一般用于分离极性较大的组分。氨基柱一般可以正相使用，也可反相使用，但是氨基柱稳定性较差，反相模式下含水量也不能太高否则键合相易水解，当有机相比例大于70%时后就是在HILIC模式下应用，此时固定相对样品的保留值与选择性都与反相模式大不相同。氨丙基固定相带正电，阴离子物质在低到中pH的条件下可通过离子交换或分配作用而加强保留。研究人员在应用氨基柱在HILIC模式下纯化样品时，可以参考上述经验。 关于SepaFlash® NH2分离柱系列产品 三泰科技推出的SepaFlash® NH2分离柱系列产品具有多种规格（参见表2）。 表2. SepaFlash® NH2分离柱参数 （填料:Ultrapure irregular NH2, 40 – 63 μm, 60 Å） Item Number Column Size Sample Size Max.Pressure (psi/bar) SW-5501-004-IR 5.9 g 5.9 mg – 118 mg 400/27.5 SW-5501-012-IR 23 g 23 mg – 0.46 g 400/27.5 SW-5501-025-IR 38 g 38 mg – 0.76 g 400/27.5 SW-5501-040-IR 55 g 55 mg – 1.1 g 400/27.5 SW-5501-080-IR 122 g 122 mg – 2.5 g 350/24.0 SW-5501-120-IR 180 g 180 mg – 3.6 g 300/20.7 SW-5501-220-IR 340 g 340 mg – 6.8 g 300/20.7 SW-5501-330-IR 475 g 475 mg – 9.5 g 250/17.2 如需进一步了解SepaBean® machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https://store.chembeango.com/。 目前对大极性化合物的研究在医药、天然产物、生化、食品安全等方面的应用逐渐提升，对大极性化合物的纯化需求也越来越多。然而在色谱纯化中，最常用的反相模式对大极性组分的纯化有自己的短板——保留太弱，而亲水作用色谱（HILIC）则弥补了反相色谱的缺点，它可提高对极性物质的保留从而获得满意的纯化效果。HILIC的应用模式与正相色谱很相似，其保留强度与溶质极性成正比，与流动相极性成反比。其保留机制是液-液分配、吸附作用、离子交换等多种作用组合，从而使HILIC与反相相比有独特的选择性。HILIC固定相是极性组分，可吸附极性溶剂和水相使固定相表面形成极性亲水层，基于相似相容的原理，则极性样品会与固定相相互作用，从而增加保留，所以流动相至少要含有3%的极性溶剂，这样才能在固定相表面形成亲水层。HILIC条件下，常用的流动相体系是乙腈和水，水作为强溶剂，乙腈作为弱溶剂，某些情况下如果水相洗脱能量太强，可用极性有机溶剂代替部分水相可增加保留时间，但不可用甲醇、乙醇等极性醇类完全替换乙腈，否则会导致保留时间不充分。常用的固定相有未衍生化硅胶或杂化颗粒、酰胺基、氨基、二醇、两性离子等，其中未衍生化的硅胶应用比较广泛，尤其是应用于药物分析和纯化方面。实验部分⑴ 样品信息待纯化样品来源于某制药公司，样品极性很大同时要求在色谱柱中有合适的保留时间，制备量在50mg左右。⑵ 制备参数取50mg粗品溶于溶剂中，超声直至澄清状态，用注射器将溶解后的样品打进色谱柱中，具体实验参数如表1所示：表1. 样品的制备参数设置仪器SepaBean  machine T 分离柱键合相系列快速分离柱，40g球形C4键合硅胶柱，20-45μm，100Å(订货号：SW-5422-40-SP)键合相系列快速分离柱，25g超纯无定形NH2键合硅胶，40-63μm，60Å(订货号：SW-5501-25-IR)流动相A：水      B：乙腈A：乙腈      B：水进样量50mg样品溶于1ml水50mg样品溶于1ml乙腈流速30ml/min20ml/min波长 254nm；220nm梯度时间/min溶剂B%时间/min溶剂B%0000180102025101520⑶ 案例小结根据图1和图2可以看出，样品组分在C4反相柱上不保留，在氨基柱上应用HILIC模式时不仅保留时间增加，三个组分ABC都达到了基线分离。⑶ 案例小结根据图1和图2可以看出，样品组分在C4反相柱上不保留，在氨基柱上应用HILIC模式时不仅保留时间增加，三个组分ABC都达到了基线分离。结果与讨论图3. 氨基柱固定相表明键合功能基团示意图氨基柱是由极性基团氨丙硅烷基键合在硅胶上制成的极性键合相色谱柱（参见图3），一般用于分离极性较大的组分。氨基柱一般可以正相使用，也可反相使用，但是氨基柱稳定性较差，反相模式下含水量也不能太高否则键合相易水解，当有机相比例大于70%时后就是在HILIC模式下应用，此时固定相对样品的保留值与选择性都与反相模式大不相同。氨丙基固定相带正电，阴离子物质在低到中pH的条件下可通过离子交换或分配作用而加强保留。研究人员在应用氨基柱在HILIC模式下纯化样品时，可以参考上述经验。关于SepaFlash® NH2分离柱系列产品三泰科技推出的SepaFlash® NH2分离柱系列产品具有多种规格（参见表2）。表2. SepaFlash® NH2分离柱参数（填料:Ultrapure irregular NH2, 40 – 63 μm, 60 Å）Item NumberColumn SizeSample SizeMax.Pressure(psi/bar)SW-5501-004-IR5.9 g5.9 mg – 118 mg400/27.5SW-5501-012-IR23 g23 mg – 0.46 g400/27.5SW-5501-025-IR38 g38 mg – 0.76 g400/27.5SW-5501-040-IR55 g55 mg – 1.1 g400/27.5SW-5501-080-IR122 g122 mg – 2.5 g350/24.0SW-5501-120-IR180 g180 mg – 3.6 g300/20.7SW-5501-220-IR340 g340 mg – 6.8 g300/20.7SW-5501-330-IR475 g475 mg – 9.5 g250/17.2如需进一步了解SepaBean® machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https://store.chembeango.com/。