核酸类药物中核苷酸的定量分析和分子量检测方案(液质联用仪)

News岛津SHIMADZUhttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2020年6月400-650-0439 ApplicationNews LC-MS 使用 LCMSTM-8060 进行 siRNA 型寡核苷酸的定量分析和分子量测定 |前言 核酸类药物是为结合特异性靶 RNA 和蛋白质设计的合成寡核苷酸。在此之前获得批准的核酸类药物大多是反义型，此外，还有适体型和 siRNA 型获得了批准。大多数的核酸类药物为20个碱基左右，分子量为6000左右。通常使用 MALDI-TOF 型、Q-TOF型质谱仪等的精密质谱分析来确认原料药的分子量。另一方面，在血液药代动力学分析等的定量分析中，一般使用灵敏度高、动态范围大的三重四极杆质谱仪。 本文中为您介绍假定分析 siRNA型核酸类药物的原料药，使用三重四极杆质谱仪 LCMS-8060分析合成双链寡核苷酸的案例。确认了 SIM (Selected ion monitoring) 的定量性能。在使用 SIM模式绘制标准曲线时，得到了1 fmol~10 pmol范围内的线性。另外，多电荷离子通过解卷积分析确认了分子量。 M. Yamada 样品 序列：样品：双链寡核苷酸(21nt) ： AS-RNA， 5 ‘-pU CGA AGU AUU CCG CGU ACG dTdT-3'Mw：6646.0(平均质量) SS-RNA， 5 ‘-pC GUA CGC GGA AUA CUU CGA dTdT-3' Mw：6669.0(平均质量) 1分析条件 HPLC和MS的分析条件如表1所示。 [HPLC的条件] (NexeraTM) 色谱柱 市售C18色谱柱(100 mm×2.1 mm l.D.， 1.7 um) 流动相 .A) 200 mM HFIP * 1 和7.5 mM TEA*2/水 B)甲醇 梯度程序 ：B浓度4%(0 min) -20%(8.0 min) 流速 ：0.2mL/min 柱温 ：75℃ 进样量 10 uL [MS的条件] (LCMS-8060) 离子源 ：负离子模式 接口电压 ：-3kV 模式 .Q3扫描(m/z 500-1800) (AS) SIM m/z 1666.0 (SS)， m/z 1659.9 雾化气流速 ：3.0L/min 干燥气流速 .5.0 L/min 加热气流速 .15.0 L/min DL温度 ：250℃ 加热模块温度：500℃ 接口温度 350°℃ SIM 色谱图 SS-Oligo 和 AS-Oligo 各100 fmol 的混合溶液的 SIM 色谱图如图1所示。使用离子对色谱法分别洗脱6.88分钟和6.94分钟，分离度R为0.3。 图2所示为两种组分的质谱。在 AS-Oligo 和 SS-Oligo 中，均检测到4至9价多电荷离子。在 SIM 色谱图中选择了4电荷离子。 0.501 [M-9H]9- [M-4H]4 1665.9 [M-7H]7- 0.25 951.4 [M-6H]6- 1110.2 [M-5H]5- 738.7 1332.5 0.001- 500 750 1000 1250 1500 m/z 图2合成寡核苷酸的质谱 标准曲线 在1 fmol~10000 fmol 的范围内获得了AS-Oligo 和 SS-Oligo 的标准曲线。进样量1 fmol (检测极限)和5 fmol (定量下限))下的 SIM色谱图如图3所示。图4所示为标准曲线。AS-Oligo的线性相关系数(R²) 为 0.997， SS-Oligo 的线性相关系数为0.995。也尝试使用MRM (Multiple reactionmonitoring)进行尝试，但定量下限为得到超过 SIM 的结果。在MRM中，校准点5 fmol 未检测到。作为参考，图5所示为进样 50 fmol 时的 MRM 色谱图。 图3合成寡核苷酸的 SIM 色谱图(H为峰高) 图4通过 SIM 色谱图得到的标准曲线 图5合成寡核苷酸的 MRM色谱图 (H为峰高) LCMS、Nexera 和 LabSolutions 是岛津制作所株式会社在日本与其他国家的商标。 ( 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ) 解卷积 通过软件 LabSolutions TM 的解卷积功能计算了分子量(图6)。如解卷积谱所示， AS-Oligo 和 SS-Oligo 的推测分子量为6645.0和6667.2，与平均分子量的误差为1.0Da 和1.8 Da， (a) (b) 多才解析八卜#：1(D)保持持：16.9 图6解卷积谱(a)AS-Oligo、(b) SS-Oligo 总结 本文介绍了使用LCMS-8060 进行 siRNA型核核苷酸的SIM 定量分析案例。在1 fmol ~ 10 pmol 的范围内可以得到标准曲线。定量下限为5 fmol， 进样10 uL时的浓度约为 3 ng/mL。 在本次寡核苷酸测定得实验中，与MRM 模式相比， SIM模式能够以更低的浓度绘制标准曲线。在 MRM 中，将8电荷离子作为前体离子时，可以得到强度最大的产物离子(数据未刊载)。但是， MRM 的定量下限不及 SIM。判断原因是产物离子的绝对灵敏度不够。 通过四极杆型质谱仪得到的质谱分辨率较低，但通过解卷积功能，可以在几 Da 的误差范围内确认分子量。 岛津应用云 ( 免责声明： ) ( *本资料未经许可不得自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 本文介绍了使用LCMS-8060进行siRNA型寡核苷酸的SIM定量分析案例。在1 fmol～10 pmol的范围内可以得到标准曲线。定量下限为5 fmol，进样10 μL时的浓度约为3 ng/mL。在本次寡核苷酸测定得实验中，与MRM模式相比，SIM模式能够以更低的浓度绘制标准曲线。在MRM中，将8电荷离子作为前体离子时，可以得到强度最大的产物离子（数据未刊载）。但是，MRM的定量下限不及SIM。判断原因是产物离子的绝对灵敏度不够。通过四极杆型质谱仪得到的质谱分辨率较低，但通过解卷积功能，可以在几Da的误差范围内确认分子量。