Ayurvedic Churna中毒草安检测方案(自动进样器)

线性校准曲线 应用气相串联四极杆质谱分析，AyurvedicChurna 中的多种农药残留 Manoj Surwade1， Sunil T Kumar1， Aarti Karkhanis1， Manish Kumar， Soma Dasguptal， Hans-Joachim Huebschmann²， 1Thermo Fisher Scientific， Mumbai， India； 2Thermo Fisher Scientific， Singapore 传统植物药；快速液/液萃取； QuEChERS；智能定时扫描(timed-SRM)；保留时间校准；MRM；离子比例确证；应用 TraceFinder 处理数据 前言 Ayurveda 是一个梵语词汇，由“ayus”和“veda.”两个词根组成，分别表示生命和科学，即生命的科学。由多种植物磨粉后混合而成的混合物称为“churna”。混合物配方依据其特定的应用目的(如医疗、美容或烹调)而变化。Avipittakarachurna 是一种广泛应用于预防代谢系统损伤；帮助消化系统去噪，预防消化不良、便秘、呕吐、厌食的日常用药。对于此类样本的分析，最大的挑战来自于添加多种草药而引入的糖类和植物天然色素所可能造成的干扰。I 干燥植物叶片经样本前处理获得包括活性成分、挥发油以及高温烹煮产生的天然聚合物在内的复杂样本提取物。由于在草药养殖生长过程中使用农药， “churna”中可能含有多种农药残留。对于此类样本中农药残留的测试分析至关重要并由政府法规管控。[21通过严格限制多种质量参数以保证“churna”的质量和有效性。 样品前处理 简而言之， QuEChERS样品前处理(见表1)是 15gAvipittakarachurna 粉末样本加入15 mL乙腈(含1%冰醋酸)及3g硫酸镁、1.5g醋酸钠和1g氯化钠。离心后取上层清液(1mL)，通过 200 mg PSA 和 10 mg GCB 吸附剂进行固相分散处理。提取物10000 rpm离心5分钟，由自动进样器取上清液 3 pL进行测试分析。回收率和方法学验证实验通过测试 15 g“churna”加入适量的农药标准混合物完成。 图1.检测 Avipittakara churna 中农药成分的样品制备过程 每种农药化合物分别称量 10±0.1 mg 溶于 10 mL 乙腈制得标准储备液，并储存于棕色玻璃容器中，置-20℃冷藏。通过稀释适量各化合物的标准储备液，获得10份浓度为 10 mg/L 的混合标准溶液(每份含有15-20种化合物)。将以上混合标准溶液各取适量，以乙腈稀释配得工作标准溶液(1mg/L)， 置-20℃冷藏。用于建立标准曲线的标准溶液浓度分别为 2.5、5、10、25和50 pg/L， 每用使用前新鲜配制。所有化合物的标准曲线图(五个点)均结合单个峰面积与相应标准溶液浓度计算而得。 仪器参数及方法设置 本次样品分析应用了 Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH液体自动进样器，配备程序升温 PTV 进样口的 Thermo ScientificTMTRACETM 1300 系列气相色谱以及 Thermo ScientificTM TSQ8000TM三重四极杆 GC-MS/MS 质谱系统。具体仪器方法参数见表1。 表1.仪器方法参数 TRACETM 1310 气相色谱仪器参数 载气 氦气 进样口 PTV 进样模式 不分流 不分流时间 3min，分流流速： 30 mL/min 87℃， 0.3 min (注射) PTV程序 14.5℃/min 升至285℃(转移) 285℃，2.5 min(转移) 14.5℃/min 升至290℃(清洁) 290℃，20 min (清洁) 色谱柱 Thermo Scientific TraceGOLDTM TG-5 SilMS 30 mx0.25mm x 0.25 um (p/n 10177894) 载气流速 1.2mL/min，恒定流速 70 ℃， 2 min 升温程序 10℃/min升至200℃ 200℃， 2 min 10℃/min 升至285℃ 285℃，8.5 min 液体进样 通过 TriPlus RSH 自动进样器进样3 pL 方法设置和数据处理均使用 Thermo ScientificTM TraceFinderTM软件。TraceFinder 软件中内置超过800种农药化合物数据库，其中包括了分析各化合物所需要的所有分析参数，例如色谱保留时间以及用于数据采集、处理的经过优化的 SRM 反应信息。该软件的优势可应用于建立大规模农药化合物筛查实验。在所有的多反应监测(MRM)分析中，每个农药化合物均有两个 SRM 离子对分析通道。其中，强度最大的离子对通道作为定量；在使用TraceFinder 软件进行数据处理时，通过第二对离子对与第一对离子对的离子强度比例以对化合物进行定性确证。软件可通过处理标准溶液样品测试数据，对测试方法中智能定时扫描(timed-SRM )数据采集方法进行校准，以锁定所有待测化合物的色谱保留时间，消除样本中生物基质所带来的影响，确保仪器的耐用性。 TSQ 8000 MS/MS 参数 离子源温度 230℃ 传输线温度 285℃ 离子化模式 EI 电离能量 70 eV MRM 检测方式 Timed SRM 模式(见图1) 采集速率 500 ms MRM 参数 见表1 TSQ 8000 质谱仪所采用的 timed-SRM 数据采集方式可有效避 免实验人员耗费大量时间精力进行分段采集时间的方法设置。待测化合物每个离子对监测时间根据指定的循环时间由工作站自动计算而得，这样可以保证在同一个循环时间内采集到所有离子对数据，无需通过扫描时间和单个离子流色谱峰中的扫描点个数进行参数优化。数据采集的驻留时间可根据 MRM 方法中化合物的数量而自动优化。表2列出了本次测试仪器方法中所有化合物的 MRM 参数。 TraceFinder 软件可同步数据处理和采集方法设定两个模块以实现方法中所有化合物色谱保留时间锁定。 Name Window [min] Pre-width [min] Post-width [min] Mass Product Mass Collision 图2.TSQ 8000 方法中 timed-SRM 采集设定的原理。中间的白色区域显示了以化合物保留时间为中心的峰宽，前后的灰色区域为时长 0.3 min 的整个 SRM 采集窗口。 Area： 127 Area： 274 图3.特定农药化合物在 2.5 ng/g 浓度下的离子流色谱图及其标准曲线 测试结果 本次测试使用液液萃取和 TSQ 8000气相三重四极杆联用系统对 Ayurvedic churnas 中的多种农药残留进行了常规检测和定量分析。TraceFinder 软件对测试中所有标准样品和待测样品实现了快速、高通量分析。所有待测化合物合准曲线在2.5至50ng/g范围内线性相关系数均大于0.99，详见图3。加标回收率均在70-120%之间，相应 RSD 小于20% 样品分析 本次采用的常规筛查方法在约28分钟的运行时间内完成了约200种农残的检测。依据上文所建立的方法对地区市场的样本进行测试。市购样本测试结果见图 4。 图4.在市市样本中检测到乙基毒死蜱和苯氧菌酯的浓度分别为 2.3 pg/kg 和 2.7 ug/kg 针对多种农药建立一种快速、灵敏的定量方法是每一个农残分析实验室的主要目标。采用上文建立的农残测试方法，可在28分钟内对200余种农药化合物完成筛查和定量分析。QuEChERS前处理方法具备高回收率和良好的重复性。配有 TRACEGuard 的 TR-5MS 色谱柱可有效分离所有目标化合物。三重四极杆质谱仪 TSQ8000 GC-MS/MS 与 TraceFinderM软件联合使用，有效节省数据处理时间，从而实现了高通量检测。在待测样本进行前处理的短暂时间内即可完成方法线性、专属性、回收率和重复性测试。TSQ8000 系统具备超高灵敏度，即使是对经过 QuEChERS 快速处理的复杂样品基质仍能实现高灵敏检测和可信定量。本方法可应用于如混合植物药等复杂基质样本中痕量农药残留的检测和和证。最低检测限可低至2.5 ng/g。依据现行的指导规范，本次测试的农残浓度(0.0023和0.0027 mg/kg)已低于尤纳尼测试指南所规定限值。3 ( [1]Narayanaswamy， V.， Origin and Development of Ayurveda (ABrief History)， Anc. S ci. L ife， Jul-Sep 1 ( 1) (1981) 1-7. ) ( [2] The Pesticides Compound D atabase， Thermo F i sherScientific， Aus t in， TX， USA， 2013. ) ( [3] Lohar， D .R.， Protocol for testing guideline for Ayurvedic，Siddha and Unani medicines Chapter 2.5.1， Governmentof India， Department of AYUSH，Ministry of He a lth & FamilyWelfare， Pharmacopoeial Laboratory for Indian Medicines，Ghaziabad， see ) http：//www.plimism.nic.in/Protocol_For_Testing.pdf 表2.待测农药化合物的 MRM 参数 编号 化合物名称 色谱保留时间[min] 定量离子对m/z 碰撞能量[V] 定性离子对m/z 碰撞能量[V] 线性回归 系数R? 180 咪鲜胺 19.88 180.01>138.01 15 310.03>268.02 10 0.9932 181 唑草胺 20.21 100.04>72.03 15 188.08>119.05 15 0.9991 182 氟氯氰菊酯，峰1 20.26 163.02>91.01 12 163.02>127.02 10 0.9915 183 腈苯唑 20.34 129.04>102.03 15 198.07>129.04 10 0.9996 184 氯氰菊酯1 20.65 163.03>127.02 10 181.03>152.03 25 0.9996 185 吡菌酰胺 20.84 342.03>140.01 15 344.03>142.01 15 0.9977 186 氟氰戊菊酯，峰1 20.85 199.07 > 107.04 22 199.07>157.06 10 0.9958 187 喹禾灵 20.92 299.07>255.06 20 372.09>299.07 15 0.9969 188 醚菊酯 21.08 163.09>107.06 16 163.09>135.07 10 0.9987 189 氟氰戊菊酯，峰2 21.12 199.07>107.04 22 199.07>157.06 10 0.9989 190 氰戊菊酯，峰1 21.94 167.05>125.04 10 419.13>225.07 10 0.9978 191 氟胺氰菊酯，峰1 22.09 250.06>200.05 20 252.06>200.05 20 0.9973 192 吡亚菌平 22.17 132.03>77.02 15 325.08>132.03 20 0.9936 193 氰戊菊酯，峰2 22.20 250.06>200.05 20 252.06>200.05 20 0.9977 194 氰戊菊酯，峰2 22.28 167.05>125.04 10 419.13>225.07 10 0.9996 195 苯醚甲环唑，峰1 22.76 323.05>265.04 15 325.05>267.04 20 0.9995 196 茚虫威 22.95 203.03>106.01 20 203.03>134.02 20 0.9996 197 溴氰菊酯Ⅱ 23.28 252.99>93.00 18 252.99>173.99 18 0.9987 198 嘧菌酯 23.63 344.10>329.10 20 388.11>345.10 15 0.9991 199 烯酰吗啉-1 23.91 301.10>165.05 10 387.12>301.10 12 0.9992 200 烯酰吗啉-2 24.60 301.10>165.05 10 387.12>301.10 12 0.9990 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermoscientific.cn 全国服务热线：8800 810 5118400 650 5118(支持手机用户) AN 10361_C_GCMSMS_201508Y SCIENTIFIC 针对多种农药建立一种快速、灵敏的定量方法是每一个农残分析实验室的主要目标。采用上文建立的农残测试方法，可在 28 分钟内对 200 余 种农药化合物完成筛查和定量分析。QuEChERS前处理方法具备高回收率和良好的重复性。配有 TRACEGuard 的 TR-5MS 色谱柱可有效分离所有目标化合物。三重四极杆质谱仪 TSQ 8000 GC-MS/MS 与 TraceFinderTM 软件联合使用，有效节省数据处理时间，从而实现了高通量检测。在待测样本进行前处理的短暂时间内即可完成方法线性、专属性、回收率和重复性测试。TSQ 8000 系统具备超高灵敏度，即使是对经过 QuEChERS 快速处理的复杂样品基质仍能实现高灵敏检测和可信定量。本方法可应用于如混合植物药等复杂基质样本中痕量农药残留的检测和确证。最低检测限可低至 2.5 ng/g。依据现行的指导规范，本次测试的农残浓度（0.0023 和 0.0027 mg/kg）已低于尤纳尼测试指南所规定限值。