大米中噻虫胺残留检测方案(液质联用仪)

LC/MS/MS 检测大米中多种农药残留 简介 大米是全球消费量最大的食品之一。为提高作物产量，人们往往在大米的 生产过程中使用多种农药，以控制杂草与病虫害的影响。由于法律、气候与生产系统的差异，稻作物所使用的农药通常具有国家/地区特点。除影响大米品质之外，大米的农药残留还威胁到一般消费者的身体健康。为规避健康风险，大米中农药残留水平的监测便显得尤为重要。包括美国、中国、巴西、印度、日本和欧盟在内的众多国家和地区已就食品与饲料(含大米)的农药最大残留限量(MRL)作出规定1。根据欧盟制定的农药最大残留限量标准，大米中的农药残留主要介于10 pg/kg-8，000 pg/kg 之间，具体取决于农药品种1。如测定的大米农药残留较低，需采用灵敏度、选择性与准确度较高的分析方法。农药多残留分析能够单次测定多种农药的残留水平，而鉴于大米生产过程中可能使用多种农药，这将是最为有效的一种方法。传统上主要通过气相色谱法/质谱分析法 (GC/MS)4.5分析农药残留的情况，但气相色谱法却并不适用于离子化合物与极性化合物，尤其是在进样口处于热不稳定状态的化合物。液相色谱-串联质谱法 (LC/MS/MS)的选择性与灵敏度较高，同时在多种样品基质中适用的化合物范围较广，现已成为农药残留分析的首选方法。6-10 包括大米在内的食品样品中，多残留分析物目前已广泛采用QuEChERS 提取方法进行分析4，8，9，10。。本研究结合修改后的 QuEChERS 提取方法与LC/MS/MS 技术，提出分析速度更快、灵敏度与选择性更高的农药多残留分析方法，对大米样品中200余种农药进行分析。通过QSight@三重四级杆质谱仪的时间管理型 MRM TM，可为目标分析物自动生成多反应监测(MRM)转换的最佳驻留时间。正如本研究中大米样品的农药多残留分析结果所示，这不仅可缩短方法制定的时间，还可改善数据质量与分析性能。 实验 硬件/软件 农药的色谱分离由珀金埃尔默 UHPLC系统完成，分析物测定则由珀金埃尔默QSight 220三重四级杆质谱检测器与双离子源进行。所有仪器控制、数据采集和数据处理皆采用 Simplicity 3Q TM软件进行。 方法 样品制备 农药标准品来自于 ULTRAScientific (罗得岛州北金斯敦)。大米样品则从加拿大安大略省的当地杂货店购得。检测的大米样品包括糙米、黑米、白米(包括泰国香米、印度香米和加州中粒米))，以及两种品牌的有机大米。样品原产地分别为泰国、越南、印度、意大利和美国。根据相应标准处理大米样品时，通过 QuEChERS 试剂盒(AOAC 2007.01方法)进行细微修改，无需分散固相萃取10。定量分析时，向 QSight LC/MS/MS 系统直接注入1uL提取液。 研究以有机机米样品作为空白对照基质。在10ug/kg 与100pg/kg 浓度条件下，通过农药加标回收试验对大米样品基质的回收率进行评估。纯溶液(乙腈)和大米样品基质(基质匹配校准品)制备有八种不同浓度的浓度点，校准曲线由此确定。此外，根据纯溶液与大米样品基质所得出的校准曲线，可通过二者的斜率比较对基质效应进行评估。为减少误报与漏报的情况，已针对每种农药开展至少两次的 MRM 转换监测。计算定量限(LOQ)时，以两次 MRM 转换的最低信噪比为10作为基础。12 LCMSMS 离子源条件 LCMSMS 离子源参数如表1所示。所研究农药 MRM通道的部分列表如表2所示。在 Simplicity 软件的时间管理型MRM中，从内置化合物库中选择特定农药，即可自动生成质谱采集法，其中包括正离子正离子和负离子负离子分析物。 表1. LCMSMS离子源条件。 液相色谱法条件 液相色谱柱 Brownlee SPP 苯基-己基柱， 100×2.1mm， 2.7 pm 流动相A 5mm甲酸铵(溶解于水) 流动相B 5mm甲酸铵(溶解于甲醇) 流动相梯度 在15分钟内将流动相B增加至95%，随后 维持状态2分钟。最后，使色谱柱在初始 条件下维持平衡状态3分钟。 柱温箱温度 40°C 自动进样器温度 15°℃ 进样体积 1.0pL 质谱分析法离子源条件 ESI电压(阳极) 5000V ESI电压(阴极) -4000V 干燥气 140 雾化气体 350 源温度 325°C HSID温度 200°C 检测模式 时间管理型MRM TM 结果与讨论 农药多残留分析的挑战 食品样品的分析 由于本研究检测的农药中同时存在极性化合物与非极性化合物，因此从样品基质中提取分析物时使用了乙腈。然而，为将极性化合物留在色谱柱上，反相液相色谱法在液相色谱分析开始时采用了含水流动相。如向液相色谱柱上注入大量有机溶剂(如乙腈样品提取物))，可能导致早期洗脱极性化合物的色谱峰受到影响。为解决这一问题，本研究仅注入少量的样品溶剂。 传统的MRM方法制定不适于单次分析大量分析物(如数百种农药残留))。以手动方式将所有参数输入分析方法中是一项费时费力的工作。此外， MRM 的驻留时间无法通过传统方式进行简单优化。因此，本研究的方法制定阶段采用了时间管理型 MRM，以提高效率、数据质量和方法性能。 样品基质效应是 LC/MS/MS 方法制定的主要关注点，鉴于食品样品基质的多样性与复杂性，食品分析则更是如此。为克服样品基质效应，目前已采用样品稀释、使用稳定同位素内标、基质匹配校准品、标准添加、样品净化、使用高效色谱柱以改善色谱分离，以及替换离子源等数种方法。11本研究基于溶剂(纯溶液)与大米样品基质得出校准曲线，通过比较纯溶液曲线的斜率(X)与大米样品基质曲线的斜率(Y)对基质效应进行评估。样品基质效应(%))可通过二者斜率的百分数差进行计 算： (Y-X)×100/X。若两条曲线的斜率百分数差为正数，则存在信号增强效应，若为负值，则存在信号抑制效应。如表3、图1与图2所示，样品基质效应与化合物存在相关性。例如，乙酰甲胺磷和丙环唑等部分农药出现信号增强(正值)，而毒死蜱和三环唑等其他农药则出现离子抑制(负值)如表3所示，大多数已研究农药的样品基质效应小于20%，因此根据欧盟法规，通过纯溶液确定的校准曲线可用于定量分析，且无显着误差。12然而，毒死蜱(-55%)和戊唑醇(-18%)的研究中却观察发现显著的离子抑制效应。因此，为克服基质效应并减少分析结果的变化，本研究中所有分析物的定量分析皆采用基质匹配校准品。 方法性能 由纯溶液与大米样品基质(基质匹配校准品)得出的所有校准曲线皆显示出良好的线性(0.1-200ng/mL)，相关系数(R2)大于0.99(典型的校准曲线示例如图1和图2所示)。 分别以 10 u g/kg 和 100 u g/kg 的两种浓度水平将分析物加入样品之中，以此评估农药的回收率。如表3所示，对于大多数所研究的农药，分析物的回收率介于70%和120%之间，相对标准偏差(RSD)小于20%。 确定定量限 (LOQ)时，同时考虑定量离子和定性离子的信号(二者信噪比>10)，确保产物离子比处于预期值的20%容差窗口范围内。?多数已检测农药的定量限介于 0.5 u g/kg 与 20 u g/kg 之间，远低于欧盟规定的最大残留限量。 表2.MRM 转换(213种研究农药的部分列表)。 图1.根据纯溶液(分析物浓度范围介于 0.1-200ng/mL之间)制备的标准品所确定的乙酰甲胺磷(A))、、1毒死蜱(B))、丙环唑(C)和三环唑(D)的校准曲线。 Standard Curve：Concentrationvs Area Standard Curve："Concentration vs Area” 图2.根据大米样品基质(分析物浓度范围介于 0.1-200ng/mL 之间)制备的标准品所确定的乙酰甲胺磷(A)、毒死蜱(B)、丙环唑(C)和三环唑(D)的校准曲线 农药 驻留时间 10 ug/kg 浓度的回收率100 ug/kg 浓度的回收率 基质效应 相关系数 (分钟) (%RSD) (%RSD) (%) (R) 乙酰甲胺磷 1.88 101.1(11.8) 81.9(4.3) 14.0 0.9997 啶虫脒 8.15 106.5(2.6) 98.7(2.3) 2.7 0.9996 噻嗪酮 15.05 103.3(2.9) 98.8(3.5) -3.1 0.9996 毒死蜱 15.54 109.6(10.4) 98.7(5.0) -55.0 0.9991 噻虫胺 6.70 105.7(5.9) 111.2(8.6) 17.0 0.9995 苄草隆 12.74 98.9(7.2) 96.1(2.5) -2.6 0.9984 苯丁锡 16.90 69.5(18.6) 78.8(12.7) 13.1 0.9997 仲丁威 11.20 101.6(2.9) 94.8(1.9) 2.6 0.9976 氟吡菌酰胺 13.00 104.8(3.6) 101.1(3.1) -2.7 0.9991 氯虫酰肼 12.26 89.4(15.2) 88.3(11.4) -4.4 0.9980 抑霉唑 14.33 89.6(13.6) 95.3(4.1) -6.1 0.9996 吡虫啉 7.57 77.5(10.8) 112.2(7.9) -5.7 0.9991 稻瘟灵 13.01 111.5(2.7) 101.1(2.3) -0.4 0.9983 马拉硫磷 13.25 92.0(12.0) 86.0(4.3) -9.9 0.9995 甲胺磷 1.41 82.8(10.1) 76.4(14.3) 13.3 0.9978 增效醚 15.26 106.0(5.0) 105.2(3.4) -6.3 0.9977 虫螨磷 14.71 107.5(3.7) 98.8(5.3) -0.1 0.9997 丙溴磷 14.82 110.7(6.9) 103.0(6.5) -2.5 0.9988 丙环唑 14.32 106.6(7.1) 98.3(2.8) 1.5 0.9994 戊唑醇 13.72 102.2(6.9) 104.2(5.5) -18.9 0.9993 噻虫嗪 6.43 116.4(10.0) 114.0(14.9) 1.9 0.9991 三唑磷 13.46 117.8(5.7) 99.5(3.0) 2.7 0.9979 三环唑 9.27 84.2(5.8) 80.7(7.8) -7.5 0.9998 肟菌酯 14.91 106.7(2.4) 106(4) -5.8 0.9991 样品分析 所制定的方法被用于分析不同食品样品中的农药残留，包括11份大米样品、1份小麦样品和1份蔬菜样品。图3显示了糙米样品中已鉴定和已定量农药的 MRM 重叠色谱图。表4列出了11份大米样品所测定的农药残留量，以及欧盟规定的最大残留限量(ug/kg) (不适用*：部分农药未于欧盟最大残留限量列表中列出，但可由本方法进行测定)。如表4所示，样品4(S4)和样品10 (S10)中测定的众多农药非常相似，原因在于两份大米样品的产地相同。这表明在大米生产期间，由于区域法规和天气条件的差异，稻作物所施加的农药具有国家或地区特点。 结论 通过使用UHPLC 系统与QSight 220三重匹极杆质谱仪，建立用于大米农药多残留分析的 LC/MS/MS 方法。该方法可用于检测大米中200余种农药，其定量限低于监管机构规定的限量。时间管理型 MRM 模块简化了质谱分析方法的制定流程，使其驻留时间得到优化，可用于监测食品样品中的大量分析物。本研究使 图3.糙米样品(S10)中测定的农药：噻虫嗪(1)、噻虫胺(2)、吡虫啉(3)、啶虫脒(4)、三环唑(5)、稻瘟灵(6)、三唑磷(7)、戊唑醇(8)、抑霉唑(9)、丙环唑(10)、丙溴磷(11)、肟菌酯(12)、噻嗪酮(13)，及毒死蜱(14)。 用的 QuEChERS 取品萃取显示，大多数农药具有良好的回收率1(70-120%)和重现性 (RSD<20%)。研究制定的分析方法表明，所检测的农药在大米基质中具有良好的线性，R2大于0.99。通过11份浓度等于或低于欧盟最大残留限量的大米样品，对农药残留进行鉴定与定量。此外， LC/MS/MS 方法还被用于其他食品分析，如品质优良的小麦和蔬菜样品等。本文提出的方法可轻易适用于多种分析物的筛选和定量，为大米样品及其他食品样品提供更具成本效益的农药检测方法。 农药 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 MRL 乙酰甲胺磷 2.0 10 啶虫脒 0.3 0.8 10 噻嗪酮 9.1 46.5 500 毒死蜱 0.5 0.3 1.4 8.7 50 噻虫胺 7.0 3.0 500 仲丁威 4.1 NA* 氟吡菌酰胺 0.5 10 氯虫酰肼 5.0 NA* 抑霉唑 1.4 2.5 4.6 2.6 1.6 50 吡虫啉 2.8 1.1 9.2 1500 稻瘟灵 4.4 9.3 2.9 14.7 5000 马拉硫磷 1.8 2.2 8000 甲胺磷 0.5 10 增效醚 0.6 1.3 0.8 NA* 虫螨磷 1.4 500 丙溴磷 5.2 10 丙环唑 8.3 8.4 6.7 4.1 18.1 1500 戊唑醇 5.9 5.2 0.9 12.0 1000 噻虫嗪 10.6 11.0 10 三唑磷 0.6 0.5 17.6 20 三环唑 16.4 5.8 7.6 20.6 0.6 40.2 1000 肟菌酯 1.6 5000 不适用*：部分农药未于欧盟最大残留限量数据库中列出，但可由本方法进行测定。 ( 1.396/2005号欧盟委员会法规(E C )——植物和动 物来源食品与饲料的农药最大残限量，欧盟杂志。 L70/1(2005)。 ) ( 2.美国国家环境保护局，联邦法规电子法典：标 号40：第180部分——食品中农药化学残留的 容忍和豁免。网址： http：/ / www.ecfr.gov/cgi-bin/ text-idx?c=ecfr&tpl=/ecfrbrowse/ T itle40/40cfr180_main_02. t pl ) ( 3.中国国家标准 GB 28260-2011。2011年，食品中 85种农药的最高残留限量，中华人民共和国卫生 部。 ) ( 4. 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