动物源性食品中药物残留检测方案(液相色谱柱)

ApplicationNote： CM0005View additional Thermo Scientific LC/MS application notes at： www.thermo.com/appnotesSCIENTIFI CPart of Thermo Fisher Scientific 高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中β-受体激动剂类药物残留 徐锦忠，丁涛1，刘飞 1.江苏出入境检验检疫局食品实验室；2.赛默飞世尔科技(上海)公司色谱质谱部 关键词：： TSQ Quantum， β-受体激动剂， LC/MS/MS Key Words ·TSQ Quantum β-受体激动剂，又称为β一兴奋剂(β-agonists) 是一类人工合成药物，主要用于防治人、兽支气管哮喘和支气管痉挛，在药学上称为β一肾上腺素兴奋剂。β一受体激动剂在体育比赛中可用于增强运动员、动物(如马)肌肉，提高运动成绩，国际奥委会将β一受体激动剂列为禁用药物。β一受体激动剂根据苯环取代基结构分为苯胺型(如：克伦特罗，俗称：瘦肉精)、苯酚型(沙丁胺醇)、间苯二酚型(如：特布他林)。 ·β一受体激动剂 80年代，国内外研究表明，在饲料中添加β-受体激动剂具有营养再分配作用，可以明显提高瘦肉率。1992年，西班牙首次发生物多人食用含β-受体激动剂的畜产品中毒事件：1997年，香港发生进食大陆供港猪的内脏引起人中毒等事件。随着中国加入WTO后，国外对于中国出口的食品提出更高的要求，最近我国因兽药残留问题出口欧盟肉制品受阻；普通大众也需要无公害食品。因此，对β一受体激动剂的分析研究不仅在临床药物代谢动力学上、体育运动中，而且在食品安全方面都有重要意义。目前，对β一受体激动剂的分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱目质谱法 (LC/MS)、酶联免疫法 (ELISA)、气相色谱-质谱法(GC/MS)等。 本文建立了猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品组织中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克克特罗、妥布特罗、喷布特罗、心得安共10种β-受体激动剂LC-MS/MS法残留检测方法。 1.实验部分 1.1仪器与试剂 TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪(赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司)，配置有电喷雾电离源(ESI)： Surveyor MS Pump液相色谱系统，包括Surveyor AS自动进样器。 标准品特布他林(Turbuterol)、西马特罗 (Cimaterol)、沙丁胺醇(Salbutamol)、非诺特罗(Fenoterol)、氯丙那林木 (Clorprenaline hydrochloride)、莱克多巴胺 (Rackdopamine)、克伦特罗 (Clenbuterol)、、妥布特罗(Tulobuterol)、喷布特罗(Penbuterol)、心得安(Propranolol) 纯度均大于98%。用甲醇溶解并配制成1.0mg/mL标准储备液，再根据需要稀释成适当含量的混合标准工作液。其他试剂均为HPLC色谱纯。 1.2样品制备 1.2.1酶解 准确角取经均质化的动物源性样品2g(精确到0.01 g)于50 mL 离心管中，加入0.2 mol/L乙酸铵溶液 (pH 5.2) 10 mL， 然后加入β一盐酸葡萄糖醛苷酶/.芳基硫酸酯酶40uL，涡旋混混3 min， 于37℃下水浴避光振荡16h。 1.2.2提取 样品酶解后放置至室温，涡旋混匀3 min， 高速离心10 min (10000 rpm))，取出上清液于另一50 mL离心管中，加入1 mol/L高氯酸溶液1 mL，涡旋混匀， 高速离心10min后，转移上清液至另另50mL离心管内。 1.2.3净化 用MCX固相萃取柱进行SPE净化。用甲醇5 mL活化固相萃取柱后，上样，抽干，然后用5%氨水甲醇溶液5mL洗脱。洗脱液在40℃下N2吹干，以20%乙腈水溶液1.0 mL溶解残渣，过0.45um滤膜，供LC/MS/MS法测定。 1.3液相色谱及质谱条件 1.3.1色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil Gold(150 2.1 mm，5um)；梯度洗脱见表1，其中A：水(!(5mM乙酸铵)：B：甲醇；流速：250uL/min；进样量：10)uL。 表1流动相梯度洗脱条件 Time (min) A ((%) B ((%) 90 10 0.5 90 10 5 10 90 10 10 90 10.1 90 10 12 90 10 1.3.2质谱条件 电喷雾电离离(ESI)，正离子模式；选择反应监控(SRM) 扫描模式，喷雾电压：4500V；离子传输管温度：350℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气为30 arb，辅助气为5arb，氩气用作碰撞气，碰撞压力为1.5 mTorr；选择反应监测(SRM) 离子对见表2。 表2β-受体激动剂类药物的SRM质谱条件 药物名称 母离子 碎片离子(碰撞能量V) 1234567 8910 特布他林(Turbuterol) 西马特罗 (Cimaterol)沙丁胺醇 (Salbutamol) 非诺特罗 (Fenoterol) 氯丙那林 (Clorprenaline hydrochloride)莱克多巴胺 (Rackdopamine) 克伦特罗 (Clenbuterol) 妥布特罗((Tulobuterol)喷布特罗 (Penbuterol) 心得安 (Propranolol) 226220240304.1214.1302277 228.1292.2260.2 107(31)，152(35)，152(15)143(22)，202(10)，160(18)148(18)，166(14)，222(11)107.1(30)，135.1(18) 119.1(27)，154(17) 121(20)，164(14)，284(8) 132(27)，168(26)，203(16)，259(8) 119(28)，154(16)，172(14)201(21)，236.2(16) 183(18)，116.2(18) 注：下划线碎片离子为定量离子 2结果与讨论 2.1方法灵敏度(定量限， LOQ)：本方法沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗、喷布特罗和心得安在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品组织中的定量限均可达0.1ug/kg， 西马特罗、特布他林为0.5ug/kg。图2为得到的典型LC/MS/MS色谱图。 图2β一受体激动剂药物LC/MS/MS色谱图 (1ng/mL) 2.2方法准确度：本方法β-受体激动剂药物在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品组织中的提取回收率均可达75 -120%，满足国内外的最低检出限要求，并且定量定性准确，重现性好。 3结论 In addition to theseoffices. Thermo FisherScientific maintainsa network of represen-tative organizationsthroughout the world. 本方法建立了β一受体激动剂药物物物在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品中的LC/MS/MS检测方法，其基本原理为：组织样品中的β一受体激动剂残留药物经酶解，用高氯酸调节pH值后，在酸性条件下沉淀蛋白，上清液再用MCX固相萃取柱净化，高效液相色谱-串联质谱 (LC/MS/MS)法检测。方法灵敏度、提取回收率、重现性等均满足国内外监控和检测要求。 赛默飞世尔科技 上海 上海浦东新金桥路27号6号楼 电话：86-21-6865 4588 传真：86-21-64457830 北京 北京市东城区安定门东大街28号 雍和大厦西楼702-715室 电话：86-10-84193588 传真： 86-10-84193589 广州 广州东风中路410-412号 健力宝大厦3003-3004室 电话： 86-20-83487138 传真：86-20-8348 6621 服务热线： 800 8105118 4006505118 www.thermo.com analyze.cn@thermofisher.com Thermo β-受体激动剂，又称为β-兴奋剂（β－agonists）是一类人工合成药物，主要用于防治人、兽支气管哮喘和支气管痉挛，在药学上称为β-肾上腺素兴奋剂。β-受体激动剂在体育比赛中可用于增强运动员、动物(如马)肌肉，提高运动成绩，国际奥委会将β-受体激动剂列为禁用药物。β-受体激动剂根据苯环取代基结构分为苯胺型（如：克伦特罗，俗称：瘦肉精）、苯酚型（沙丁胺醇）、间苯二酚型（如：特布他林）。80年代，国内外研究表明，在饲料中添加β-受体激动剂具有营养再分配作用，可以明显提高瘦肉率。1992年，西班牙首次发生物多人食用含β-受体激动剂的畜产品中毒事件；1997年，香港发生进食大陆供港猪的内脏引起人中毒等事件。随着中国加入WTO后，国外对于中国出口的食品提出更高的要求，最近我国因兽药残留问题出口欧盟肉制品受阻；普通大众也需要无公害食品。因此，对β－受体激动剂的分析研究不仅在临床药物代谢动力学上、体育运动中，而且在食品安全方面都有重要意义。目前，对β-受体激动剂的分析方法有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱－质谱法（LC/MS）、酶联免疫法（ELISA）、气相色谱-质谱法(GC/MS)等。本文建立了猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品组织中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗、喷布特罗、心得安共10种β-受体激动剂LC-MS/MS法残留检测方法。