阿托伐他汀中阿托伐他汀杂质H检测方案(液质联用仪)

SSL-CA09-924Excellence in Science Excellence in ScienceLCMS-IT-TOF-037 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统定性检测阿托伐他汀药物杂质 LCMS-IT-TOF-037 摘要：本文建立了使用2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统定性检测阿托伐他汀药物中4个已知杂质(阿托伐他汀杂质A、阿托伐他汀杂质F、阿托伐他汀杂质G以及阿托伐他汀杂质H)和1个未知杂质(阿托伐他汀脱氢酸)的方法。该方法使用非挥发性的柠檬酸酸缓冲盐作为流动相对药物主成分和杂质进行了分离，并通过 LCMS-IT-TOF 在线线目标杂质进行MS定性分析。该系统由于无需将非挥发性缓冲盐转换为挥发性缓冲盐，因此，可以将药典的方法直接使用，大大节省了方法开发人员的时间，并且保证了杂质定性的准确度。 关键词：阿托伐他汀杂质离子对试剂 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统 目前，根据药典的规定和分离的要求，很多药品都在使用磷酸盐作为缓冲液或离子对试剂。但它们作为非挥发性的盐，不能进入质谱，这在极大程度上影响了质谱作为定性工具在药品杂质鉴定上的使用。在2DLC-IT-TOF 使用之前，研究机构和药厂通过方法转换(将磷酸盐转换成挥发性缓冲盐)来实现质谱鉴定，但这是 实验部分 1.1仪器 分析仪器： 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统，包括LC-20ADx4(输液泵)， SIL-20AC(自动进样器)， CTO-20AC(柱温箱)， CBM-20A(系统控制器)， DGU-20A，(在线脱气机)， SPD-M20A(二极管阵列检测器)， SPD-20A (UV检测器)，FCV-12AHx3(高压流路选择阀)， FCV-14AHx2(色谱柱切换阀)，LCMS-IT-TOF(离子阱-飞行时间质谱)和LCMSsolution Ver.3.60(工作站)。 1.2分析条件 1.2.1液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack VP-ODS， 4.6mm I.D.x250mmL.， 5um 流动相A：柠檬酸缓冲液/乙腈/四氢呋喃=400/100/100(v/v)，(柠檬酸缓冲液：10.5g柠檬酸单水合物溶于900 mL水中，28%的氨水调pH值到5.0，然后加水定容到1L) 流动相B：乙腈/四氢呋喃=1/1(v/v) 时间程序：7%B(0~40 min) ~40 %B (40~80min)~7%B (10.01~95 min) 流速：1.3mL/min 柱温：40℃ 进样体积： 20pL 检测波长：190~350nm(检测：254nm) 个费时费力的工程，并且有可能因为保留时间的改变而丢掉一些未知杂质。2DLC-IT-TOF 系统克服了这一局面，用户即使使用磷酸盐或离子对试剂，也可以在线使用 IT-TOF 进行杂质鉴定。本文使用2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统定性检测了阿托伐他汀药物中4个已知杂质和1个未知杂质。供相关人员参考。 ( ) ( 色谱柱： Shim-pack XR-ODS 2.0mm I.D.x50mm， ) 2.2um 流动相A： 0.1%甲酸 流动相B：乙腈 时间程序：10%B(0 min) ~ 90 %B (10 min)~10%B (10.01~20 min) 流速：0.3 mL/min 柱温：40℃ 进样体积：5pL(Loop 环体积) 检测波长：254nm 1.2.2质谱条件 分析仪器：：LCMS-IT-TOF 离子源：ESI(+)，ESI(-) 离子源接口电压： ESI(+)，4.5kV； ESI(-)，-3.5kV： 检测器电压：1.7kV 雾化气：氮气1.5L/min 干燥气：氮气10L/min 碰撞气：氩气 脱溶剂管温度：200℃ 加热模块温度：200℃ 质量数范围：m/z 200~800 多级质谱检测： Auto MS" 1.33系统流路图 LC-20AD 图12D-LC-IT-TOF 的系统流路图 1.4样品制备 使用流动相配制阿托伐他汀药物，样品浓度为1 mg/mL， 过滤后进样分析。 本次实验涉及的药物主成分及已知的4个杂质的信息如下： 成分 中文名称 英文名称 分子式 分子量 CAS No. 结构式 主成分 阿托伐他汀 Atorvastatin C33H35FN2O5 558.64 110862-48-1 Hy oH oH。CH： 已知杂质1 阿托伐他汀杂质 F Atorvastatin AmideAcid C40H48FN3O： 717.82 已知杂质2 阿托伐他汀杂质A AtorvastatinDesfluoro impurity C33H36FN2O5 540.65 433289-83-9 HyCo川 oH oCHs 已知杂质3 阿托伐他汀杂质 G 3-O-Methylatorvastatin Lithium Salt C34H37FN2O5 572.67 887196-29-4 F H，C HC" 已知杂质4 阿托伐他汀杂质H AtorvastatinLactone C33H33FN2O4 540.63 125995-03-1 HC 结果讨论 2.1 LC 1stD分析结果 1stD分析的主要目的为确定目标杂质的保留时间，以便于捕集到 LOOP环中，用于二维脱盐分析。本次实验1stD色谱图如下，主成分和5个杂质的出峰时间分别为：17.361 min， 11.454 min， 13.762 min， 14.436 min， 35.705min 和 42.152 min， 其中R.T= 13.762 min 的杂质为客户关注的未知杂质，其他4个为药典中报道的杂质。 图2 LC 1stD分析色谱图 2.2 LC 2stD 分析结果 2.2.1已知杂质1的分析结果 已知杂质1(R.T. = 11.454 min )切换到 LOOP环1中，经过2D LC分析，得到UV色谱图、MS色谱图和质谱图如下。从MS质谱图可以看出已知杂质1负离子模式 m/z =716.3344，确证为阿托伐他汀杂质F， 分子式为 C40H4gFN，Os，理论值[M-H]-=716.3353，测试值与理论值质量数偏差为-1.26ppm。 2.2.2已知杂质2的分析结果 已知杂质2(R.T. = 14.436 min ) 切换到 LOOP 环3中，经过 2D LC分析，得到 UV 色谱图、MS色谱图和质谱图如下。从 MS 质谱图可以看出已知杂质2存在两个峰，正离子模式分别为 m/z=541.2697 和m/z = 557.2446，从LC1stD分析色谱图可以看到已知杂质2和未知杂质的保留时间差异不大，所以，可能有部分未知杂质切到 LOOP 3 中，已知杂质2为阿托伐他汀杂质A， 分子式为 C，3HN0s， m/z =541.2697，理论值[M+H]*=541.2697，测试值与理论值质量数偏差为 0.00 ppm。 2.2.3E已知杂质3的分析结果 已知杂质3(R.T. =35.705 min )切换到 LOOP环4中，经过2DLC分析，得到UV色谱图、MS色谱图和质谱图如下。从MS质谱图可以看出已知杂质3正离子模式m/z= 573.2748，为阿托伐他汀杂质G， 分子式为 C，4H，FN，Os，理论值[M+H]+=573.2759，测试值与理论值质量数偏差为-1.92 ppm。 2.2.4 已知杂质4的分析结果 已知杂质4(R.T. = 42.152 min )切换到 LOOP 环5中，经过2D LC分析，得到UV色谱图、MS色谱图和质谱图如下。从 MS 质谱图可以看出已知杂质4正离子模式 m/z=541.2503， 为阿托伐他汀杂质H， 分子式为 C3HgFN，O4，理论值[M+H]*=541.2497，测试值与理论值质量数偏差为 1.11 ppm。 250 500 m/z 250 500 m/z 2.2.5 未知杂质的分析结果 未知杂质(R.T.=13.762 min ) 切换到 LOOP 环2中，经过2D LC分析，得到UV 色谱图、MS色谱图和质谱图如下。 (x10，000.000 从MS 质谱图可以看出未知正离子模式 m/z = 557.2449，相对于主成分阿托伐他汀(分子式C3HsFN，Os， 正离子模式 m/z = 559.2603)少了2个质量数，可能是脱氢产物。经文献检索，未知杂质可能为阿托伐他汀脱氢酸，分子式为 C，HFNO，详细信息列于下表。 中文名称 英文名称 分子式 结构式 测试值M+H1 理论值[M+H] 质量数偏差 (ppm) 阿托伐他汀脱氢酸 AtorvastatinDehydro Acid C33 H33FN20s H；C OHOH 557.2449 557.2446 0.54 根据MS'的碎片信息，推测其裂解规律律： 结论 本文建立了一种使用非挥发性缓冲液作为流动相，2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统在线定性检测阿托伐他汀药物中4个已知杂质和1个未知杂质的方法。该方法由于保留了药典分析所用的流动相，即保证了杂质定性的准确性，又大大节省了方法开发人员的时间。 岛津全球应用技术开发支持中心 建立了使用2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统定性检测阿托伐他汀药物中4个已知杂质（阿托伐他汀杂质A、阿托伐他汀杂质F、阿托伐他汀杂质G以及阿托伐他汀杂质H）和1个未知杂质（阿托伐他汀脱氢酸）的方法。该方法使用非挥发性的柠檬酸酸缓冲盐作为流动相对药物主成分和杂质进行了分离，并通过LCMS-IT-TOF在线对目标杂质进行MS定性分析。该系统由于无需将非挥发性缓冲盐转换为挥发性缓冲盐，因此，可以将药典的方法直接使用，大大节省了方法开发人员的时间，并且保证了杂质定性的准确度。