中药材中刀菌烯醇-3-葡萄糖苷检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 LC-MS/MS 法测定十六种真菌毒素 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8040 联用测定16种真菌毒素的方法。该方法在 24 min 内完成16种常见真菌毒素的分离，使用内标法定量分析。16种真菌毒素线性良好，在不同浓度下精密度实验得到的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在 0.06~0.45%和 1.06~4.96%之间，结果表明仪器精密度良好；方法检出限和方法定量限分别介于0.01~22.8pg/L 和 0.03~68.4ug/L之间。 关键词：高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪真菌毒素 真菌毒素(Mycotoxins)是产毒真菌在一定环境条件下产生的次级代谢产物，容易在某些中药的种植、储存过程中产生。可引起人类和动物急性或慢性中毒，部分已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。目前已知的真菌毒素有200多种，按其主要产毒菌种可分为曲霉菌毒素(如黄曲霉毒素、棕曲霉毒素等)、青霉菌毒素和镰刀菌毒素(如T-2毒素、HT-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等)等几大类。我国、欧盟以及美国对各种毒素的限量和检测手段趋于严格。 本文使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱LCMS-8040联用，建立了十六种真菌毒素的超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用的分析方法，，供相关人员参考。 1实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8040 联用系统。具体配置为： LC-30ADx2输液泵， DGU-20As在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30A 柱温箱， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8040 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.50 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 分析仪器：LC-30A系统色谱柱： Shim-pack XR-ODS Ⅲ， 2.0 mmx75mm L， 1.6 um粒径流动相：A相-0.02%甲酸和2 mM乙酸铵水 流 速：0.3mL/min 进样体积：3uL 柱 温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%， 溶液；B相-甲醇 时间程序见表1。 表1.梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.0 Pumps Pump B Conc 20 11.0 Pumps Pump B Conc 35 13.0 Pumps Pump B Conc 50 14.0 Pumps Pump B Conc 50 18.0 Pumps Pump B Conc 95 20.0 Pumps Pump B Conc 95 20.1 Pumps Pump B Conc 10 21.0 Pumps Pump B Conc 10 21.1 Pumps Pump B Conc 20 24.0 Controller Stop 质谱条件 分析仪器：LCMS-8040脱溶剂管温度：250℃离子源：ESI， 正负离子扫描加热模块温度：450℃离子源接口电压：4.5kV；-3.5kV扫描模式：多反应监测(MRM)雾化气：氮气 3.0L/min驻留时间：10 ms干燥气：氮气 15 L/min延迟时间：1ms碰撞气：氩气MRM 参数：见表2 表2.化合物信息和MRM参数 No. 中文名称 英文名称 CAS No. 前体 离子 产物 离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 1 雪腐镰刀菌 Nivalenol 357.2 281.1 16 15 19 烯醇 (NIV) 311.3 16 10 21 13c-雪腐镰 2 刀菌烯醇 13C-NIV 372.2 295.1 16 15 19 3 脱氧雪腐镰 刀菌烯醇-3- 葡萄糖苷 Deoxynivalenol-3-glucoside (DON-3-G) 131180-21-7 476.2 297.1 -23 -13 -20 459.1 -23 -7 -22 4 脱氧雪腐镰 Deoxynivalenol 51481-10-8 297.0 249.1 -30 -11 -16 刀菌烯醇 (DON) 203.1 -30 -16 -13 C-脱氧雪 5 腐镰刀菌烯 13C-DON 312.0 263.1 -30 -11 -16 醇 6 3-乙酰基脱 氧雪腐镰刀 菌烯醇 3-Acetyldeoxynivalenol (3-AcDON) 50722-38-8 339.0 231.1 -16 -14 -25 203.0 -16 -18 -21 C-3-乙酰 7 基脱氧雪腐 13C-3-AcDON 356.0 245.1 -16 -14 -25 镰刀菌烯醇 15-乙酰基脱 15-Acetyldeoxynivalenol 321.0 -16 -8 -22 8 氧雪腐镰刀 菌烯醇 88337-96-6 339.0 (15-AcDON) 137.1 -16 -11 -26 9 黄曲霉毒素 Aflatoxin G2 7241-98-7 331.1 313.1 -17 -21 -27 G2 (AFG2) 245.0 -17 -28 -26 *表示定量离子 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 1.3样品制备 样品前处理方法：准确称取5g(精确到0.001g) 样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(80：19：1，体积比)溶液，并用旋涡混合器混匀，置于旋转摇床上振荡提取 30分钟，然后以3500g离心10 min， 准确转移 0.5 mL 上清液于2 mL离心管中，加入0.5 mL水，旋涡混匀后，在10℃下以12000转/分的转速下离心15 min， 液体过 0.2 um 的聚四氟乙烯膜。取180 uL滤液，加入20 uL稳定同位素混合溶液，供超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱测定时使用。 标准溶液配制：用甲醇配制如表3所示浓度的16种混合标准溶液的储备液。再用上述前处理方法处理的空白基质溶液稀释5倍、10倍、20倍、40倍、80倍、160倍，得到不同浓度的基质加标样品。取180 uL 各浓度溶液，加入20 uL 稳定同位素混合溶液。 表3.16种真菌毒素储备液浓度 毒素 标样浓度 内标浓度 毒素 浓度 内标浓度 (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) NIV 40 20 AFB1 0.08 0.0893 DON 1.5 1.5 HT-2 0.5 1 DON-3-G 1.5 1.5 T-2 0.5 0.2 3-AcDON 4 4 ZEN 0.6 2 15-AcDON 2 2 OTA 0.05 0.1 AFG2 0.06 0.0334 ST 0.05 0.1 AFG1 0.08 0.1046 FB1 1 2 AFB2 0.04 0.0304 FB2 1 1 2结果与讨论 2.1标准样品的 MRM色谱图 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 (x1，000) -339.00>321.00(+) 4.0-339.00>137.10(+) 3.0 2.0- 1.0- 1.00- 0.75- 0.50- 0.25 0.00- 7.5- 5.0- 2.5- 0.0- 4.0 3.0- 2.0- 1.0- 0.0 16.FB2 图1.十六种真菌毒素标准样品的MRM 色谱图(20倍稀释液) 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 2.2线性关系 将酒制的储备液用空白样品基质稀释5倍、10倍、20倍、40倍、80倍、160倍，得到不同浓度的基质加标样品。取180 pL 各浓度溶液，加入20 pL 稳定同位素混合溶液。按1.2中的分析条件进行测定，内标法制作校准曲线，如下图所示线性良好。线性方程、相关系数和线性范围见表4。 图2.十六种真菌毒素标准工作曲线 表4.十六种真菌毒素的校准曲线参数 No. 名称 校准曲线 相关系数R 检出限 定量限 (ug/L) (ug/L) 1 NIV Y=(1.90823)X+(0.0082715) 0.9986 22.80 68.40 2 DON Y=(1.21726)X+(0.0159579) 0.9989 0.70 2.10 3 DON-3-G Y=(1.30170)X+(0.0524506) 0.9980 2.00 6.00 4 3-AcDON Y=(0.829012)X+(0.0838775) 0.9993 2.30 6.90 5 15-AcDON Y=(1.79807)X+(0.0382715) 0.9997 3.00 9.00 6 AFG2 Y=(1.01146)X+(0.143447) 0.9997 0.40 1.20 7 AFG1 Y=(1.25170)X+(-0.0722204) 0.9998 0.20 0.60 8 AFB2 Y=(1.01826)X+(0.181433) 0.9981 0.02 0.06 9 AFB1 Y=(0.849061)X+(0.197427) 0.9977 0.01 0.03 10 HT-2 Y=(0.898864)X+(0.0225015) 0.9994 0.24 0.72 11 T-2 Y=(0.817340)X+(0.142064) 0.9991 0.11 0.33 12 ZON Y=(0.905326)X+(0.0268996) 0.9993 0.18 0.54 13 OTA Y=(1.97356)X+(0.00257385) 0.9991 0.21 0.63 14 ST Y=(1.69538)X+(-0.0130911) 0.9991 0.05 0.15 15 FB1 Y=(0.927354)X+(0.0164916) 0.9997 0.98 2.95 16 FB2 Y=(0.895026)X+(0.0248592) 0.9995 1.02 3.06 2.3精密度实验 对1.3中配制的不同浓度混合标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表5所示。2个浓度标准品的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.06~0.45%和 1.06~4.96%之间，仪器精密度良好。 表5.保留时间和峰面积重复性结果(n=6) No 样品名称 RSD%(10倍稀释液) RSD%(80倍稀释液) R.T Area R.T Area NIV 0.45 3.90 0.18 3.70 2 DON 0.42 4.96 0.13 3.77 3 DON-3-G 0.15 3.05 0.12 3.29 4 3-AcDON 0.18 2.14 0.09 4.18 5 15-AcDON 0.08 2.84 0.08 3.64 6 AFG2 0.07 3.74 0.09 3.40 7 AFG1 0.15 4.82 0.09 4.27 8 AFB2 0.11 3.03 0.08 3.91 9 AFB1 0.17 2.10 0.08 1.06 10 HT-2 0.06 3.87 0.07 3.71 11 T-2 0.17 2.52 0.09 2.47 12 ZON 0.15 3.27 0.08 2.13 13 OTA 0.13 3.75 0.08 1.85 14 ST 0.19 2.73 0.12 1.40 15 FB1 0.20 2.78 0.17 2.47 16 FB2 0.22 3.12 0.12 3.12 2.4每敏度分析 2.5基质加标实验 将基质按照1.3进行处理后加混标至浓度为80倍稀释液浓度，平行3份样品测定回收率和RSD。具体结果如表6，样品加标回收率在91.3~107.9%之间。 表6.加标样的回收率结果(n=3) No. 样品名称 回收率(%) RSD% 1 NIV 95.1 4.37 2 DON 93.7 3.87 3 DON-3-G 96.2 3.40 4 3-AcDON 107.9 3.54 5 15-AcDON 106.3 4.47 6 AFG2 91.3 4.81 7 AFG1 92.4 3.94 8 AFB2 94.6 2.52 9 AFB1 95.6 3.30 10 HT-2 103.2 5.07 11 T-2 106.6 4.66 12 ZON 106.2 5.18 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 13 OTA 105.3 3.40 14 ST 105.0 4.85 15 FB1 91.8 3.02 16 FB2 95.0 3.67 3结论 建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8040 联用测定十六种真菌毒素的方法。该方法在24 min 内完成黄曲霉毒素、呕吐毒素、伏马毒素等十六种真菌毒素的分离。不同浓度的精密度实验结果表明：保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.06~0.45%和1.06~4.96%之间，仪器精密度良好；基质加标校准曲线相关系数均大于0.995，方法检出限和方法定量限分别介于 0.01~22.8 ug/L 和 0.03~68.4 ug/L 之间。该方法分析速度快、重复性好、灵敏高，适合多种真菌毒素的高灵敏度同时检测。 色 谱 柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ, 2.0 mm×75mm,1.6 μm流 动 相：A相-0.02%甲酸和2 mM乙酸铵水溶液；B相-甲醇流 速：0.3 mL/min进样体积：3 μL柱 温：40℃洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，